2.1.4.1. Dung dịch
Các dung dịch dùng cho tách chiết và điện di DNA
Dung dịch I (Sol I): Tris-HCl 25 mM, pH 8; EDTA 10 mM, pH 8; glucose 50 mM. Dung dịch II (Sol II): NaOH 0,2 %; SDS 1 %. Dung dịch III (Sol III): kali acetate 3 M; acid acetic 5 M. Dung dịch đệm SCED: sorbitol 1 M; sodium citrate 10 mM pH7,5; EDTA 10 mM; DTT 10 mM. Dung dịch đệm TE: Tris HCl 10 mM; pH 7,4; EDTA 1 mM, pH 8. Dung dịch chloroform/isoamylalcohol (24:1): 24 lần thể tích chloroform hòa vào với 1 lần thể tích isoamylalcohol. Dung dịch phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1): 25 lần thể tích phenol cộng với 24 lần thể tích chloroform và 1 lần thể tích isoamylalcohol. Dung dịch đệm TAE 50 lần (50X - 100 ml): Tris 24,2 %; acid acetic: 5,71 ml; EDTA 0,5M pH 8: 10 ml. Đệm tra mẫu (loading dye 6X): Bromophenol blue 0,25 %; xylen cyanol FF 0,25 %; glycerol 30 %. Dung dịch nhuộm gel: ethidium bromide (EtBr) 0,5 g/ml.
Các dung dịch dùng trong điện di Glycine-SDS-PAGE
AB 30-0,8: hòa tan 30 gam acrylamide và 0,8 gam bis-acrylamide trong 100 ml nƣớc cất vô trùng, bảo quản ở 4oC. Đệm Tris-HCl, pH 8,8: Tris 0,75 M; SDS 0,2 %, chỉnh pH đến 8,8 bằng HCl. Đệm Tris-HCl, pH 6,8: Tris 0,25 M; SDS 0,2 %, chỉnh pH đến 6,8 bằng HCl. SDS 10 %; glycerol 50%; APS 10%; TEMED. Đệm xử lý mẫu (Treatment buffer 6X) : Tris-HCl (pH 6,8) 350mM; glycerol 30%; SDS: 10%; 2-Mercaptoethanol: 6%; Bromophenol blue: 0,012%. Đệm chạy điện di (Running buffer), pH 8,4: Tris 0,05 M; Glycine 0,192 M; SDS 0,1 %. Dung dịch nhuộm gel (Coomassie brilliant blue - CBB): CBB R-250 0,1%; methanol 40 %; acid acetic 10 %. Dung dịch rửa gel: methanol 30%; acid acetic 10%.
41
Các thành phần cho một bản gel Glycine - SDS:
STT Hóa chất Gel tách 12,6% (4,5 ml) Gel cô 0,5% (0,8 ml)
1 H2O 0,55 ml 0,45 ml 2 Tris-HCl 1,125 ml (1,5 M; pH 8,8) 0,2 ml (0,5 M; pH 6,8) 3 Glycerol 50% 0,9 ml 4 AB 30-0,8 1,89 ml 0,14 ml 5 SDS 10% 45 l 4 l 6 APS 10% 30 l 8 l 7 TEMED 3 l 1 l
Các dung dịch dùng trong điện di protein Tricine-SDS-PAGE
Điện di Tricine-SDS-PAGE đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Schagger [89] gồm có các hóa chất và dung dịch sau: Dung dịch acrylamide-bisacrylamide (AB)-3: hòa tan 48 g acrylamide và 1,5 g bisacrylamide (Serva) trong 100 ml vào nƣớc cất vô trùng, bảo quản ở 7 - 10o
C. Đệm gel (Gel buffer 3X): Tris 3 M; HCl 1 M; SDS 0,3%, chỉnh pH đến 8,45. Glycerol. APS 10%. TEMED. Đệm xử lý mẫu (treatment buffer 4X): SDS 12%; mercaptoethanol 6%; glycerol 30%; Coomassie blue G-250 0,05%; Tris/HCl (pH 7.0) 150 mM. Đệm chạy điện di cathode: Tris 0,1 M; Tricine 0,1 M; SDS 0,1%; điều chỉnh pH đến 8,25. Đệm chạy điện di anode: Tris 0,1 M; HCl 0,0225 M; điều chỉnh pH đến 8,9. Dung dịch cố định gel (fixing solution - dùng cho nhuộm bạc và cosmasie): methanol 50%; acetic acid 10%; ammonium acetate 100 mM. Dung dịch nhuộm gel (Coomassie brilliant blue G- CBB): CBB G-250 0,025%; acid acetic 10 %. Dung dịch rửa gel: acid acetic 10%
Các thành phần của gel Tricine-SDS:
Hóa chất Gel 4% Gel 16%
AB-3 Gel buffer (3X) Glycerol H20 APS (10%) TEMED (ml) (ml) (g) (ml) (l) (l) 1 3 _ 12 90 9 10 10 3 30 100 10
42
Các dung dịch dùng trong nhuộm bạc
Dung dịch Sensitize: sodium thiosulfate 0,005%. Dung dịch bạc: silver nitrate 0,1%. Dung dịch hiện màu: sodium carbonate 2%; formaldehide 0,036%. Dung dịch dừng phản ứng: EDTA 50 mM
Các dung dịch dùng trong Western blot
Dung dịch chuyển màng (blotting buffer 1X): Tris-HCl 25 mM; glycine 192 mM; methanol: 20%. Dung dịch TBS: Tris-HCl 0,5 M pH 7,5; NaCl 2,5 M. Dung dịch TTBS: dung dịch TBS bổ sung 0,05% Tween-20. Dung dịch sữa: 5% sữa tách bơ (skim milk) trong TBS. Hỗn hợp hiện màu gồm dung dịch 1: 5 ml methanol + 15 mg chất hiện màu (4-chlorol-1-naphtol) và dung dịch 2: 25 ml TBS + 15 l H2O2 30% (trƣớc khi hiện màu trộn hai dung dịch này với nhau).
Các dung dịch dùng trong xử lý protein tái tổ hợp ở dạng thể vùi
Đệm B1: Tris 20 mM; EDTA 1 mM; NaCl 500 mM, chỉnh pH đến 8 bằng HCl. Dung dịch đệm phá tế bào: đệm B1 + lysozyme 0,1 mg/ml + PMSF 0,5 M. Dung dịch đệm rửa (washing buffer): đệm B1 + urea 2 M + DTT 10 mM hoặc đệm B1 + triton X-100 0,1%. Dung dịch biến tính protein: đệm B1 + urea 8 M
Các dung dịch dùng trong tinh sạch sơ bộ protein tái tổ hợp
Dung dịch 1: natri phosphate 20 mM, pH 5,8. Dung dịch 2: 2-propanol 85%, pH 2,0. Dung dịch 3: 2-propanol 20% trong dung dịch TFA 0,1%.
Các dung dịch dùng cho pha môi trường nuôi cấy
Dung dịch YNB 10 lần (yeast nitrogen base with ammonium sulfate without aminoacids - 10X): hòa tan hoàn toàn 134 g YNB vào 1000 ml nƣớc, lọc vô khuẩn, giữ ở 4oC. Dung dịch H 100 lần (histidine 0,4% - 100X): hòa tan 400 mg L- histidine vào 100 ml nƣớc, lọc vô khuẩn, giữ ở 40C. Dung dịch B 500 lần (biotin 0,02% - 500X): hòa tan 20 mg biotin vào 100 ml nƣớc, lọc vô khuẩn, giữ ở 4oC. Dung dịch D 10 lần (dextrose 20% - 10X): hòa tan 200 g D-glucose vào 1000 ml nƣớc, khử trùng nhiệt hoặc lọc vô khuẩn. Dung dịch GY 10 lần (glycerol 10% - 10X). Dung dịch M 10 lần: (methanol 5% - 10X). Hòa 5 ml methanol vào 95 ml nƣớc, lọc vô khuẩn, giữ ở 4o C. Dung dịch đệm potassium phosphate 1 M, pH 6: hòa
43
132 ml dung dịch K2HPO4 1 M với 868 ml dung dịch KH2PO4 1 M, chỉnh pH đến 6 bằng H3PO4 hoặc KOH. Dung dịch CaCl2 0,1 M vô trùng, giữ ở 4o C. Dung dịch GYP (glycerol - yeast extract - peptone): glycerol 50%, yeast extract 10%, peptone 20%.
2.1.4.2. Môi trƣờng
Môi trƣờng BHI, MRS (Merk)
Môi trƣờng LB lỏng: cao nấm men 0,5%; tryptone 1%; NaCl 1%
Môi trƣờng chọn lọc LBA lỏng: LB lỏng bổ sung Amp nồng độ 100 g/ml. Môi trƣờng LB đặc: LB lỏng bổ sung 1,6% agar.
Môi trƣờng LBA đặc: LBA bổ sung bổ sung Amp nồng độ 100 g/ml. Môi trƣờng LB nồng độ muối thấp: LB 0,5% NaCl.
Môi trƣờng YPD: cao nấm men 1%; peptone 2%; dextrose 2%.
Môi trƣờng MD (minimum dextrose medium - môi trƣờng tối thiểu chứa dextrose): YNB 1,34%; dextrose 1%; biotin 4x10-5 %. Khử trùng 800 ml nƣớc, làm nguội đến 60o C, sau đó thêm vào 100 ml dung dịch YNB 10X, 2ml dung dịch B 500X.
Môi trƣờng MGY (Minimum Glycerol Medium - môi trƣờng tối thiểu chứa glycerol): YNB 1,34%; glycerol 1%; biotin 4x10-5 %. Hòa vào 800 ml nƣớc vô trùng 100 ml YNB 10x, 2 ml B 500X và 100 ml GY 10X.
Môi trƣờng BMG (buffered minimal glycerol - môi trƣờng tối thiểu chứa đệm và glycerol): potassium phosphate 100 mM, pH 6; YNB 1,34%; glycerol 1%; biotin 4x10-5 %. Hòa vào 700 ml nƣớc vô trùng 100 ml potassium phosphate 1 M, pH 6; 100 ml YNB 10X; 2ml B 500X và 100ml GY10X.
Môi trƣờng BMM (buffered minimal glycerol - môi trƣờng tối thiểu chứa đệm và methanol): potassium phosphate 100 mM, pH 6; YNB 1,34%; methanol 0,5%; biotin 4x10-5 %. Hòa vào 700 ml nƣớc vô trùng 100 ml potassium phosphate 1 M, pH 6; 100 ml YNB 10X; 2 ml B 500X và 100ml M 10X.
Môi trƣờng BMGY (buffered glycerol-complex medium - môi trƣờng đầy đủ - glycerol): 1% cao nấm men; 2% peptone, potassium phosphate 100 mM, pH 6;
44
YNB 1,34%; glycerol 1%; biotin 4x10-5 %. Hòa 10 g cao nấm men và 20 g peptone vào 700 ml nƣớc, khử trùng, để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm vào 100 ml potassium phosphate 1 M, pH 6; 100 ml YNB 10X; 2 ml B 500X và 100 ml GY10X.
Môi trƣờng BMMY (Buffered Glycerol-complex Medium - môi trƣờng đầy đủ - methanol): 1% cao nấm men; 2% peptone, potassium phosphate 100 mM, pH 6; YNB 1,34%; methanol 0,5%; biotin 4x10-5 %. Hòa 10 g cao nấm men và 20 g peptone vào 700 ml nƣớc, khử trùng. Để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm vào 100 ml potassium phosphate 1 M, pH 6; 100 ml YNB 10X; 2 ml B 500X và 100 ml M 10X.