1.4.1. Vấn đề oxy hĩa chất béo thịt cá
Cá được coi là một trong những nguồn dinh dưỡng quan trọng cho con người bởi vì trong cơ thịt cá chứa nhiều acid béo khơng no cao phân tử lượng, đặc biệt là acid béo docosahexaaenoic (DHA; 22:6n-3), eicosapentaenoic (EPA; 20:5n-3). Các acid béo khơng no cao phân tử lượng cĩ rất nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con người như
Chất béo Peroxyde
Vitamine Chất màu Protein
Thay đổi giá trị dinh dưỡng Mất màu , làm thay đ ổi màu
Thay đổi cầu nối S - S
Oxy hĩa protein
Aldehyd e , alcol, acid, epoxyd e , c eton e , polyme , oxy hĩa sterol ,…
làm giảm nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, tăng khả năng hình thành tế bào não và phát triển chức năng mắt của trẻ nhỏ, tăng khả năng miễn dịch. Tuy nhiên các acid béo khơng no cao phân tử lượng rất dễ bị oxy hĩa làm cho cá trở thành thực phẩm dễ bị hư hỏng nhất sau thu hoạch làm giảm thời hạn sử dụng. Oxy hĩa chất béo được coi là một trong những nguyên nhân chính làm giảm chất lượng của thực phẩm, làm biến đổi màu sắc, mùi vị, trạng thái cơ thịt và làm giảm giá trị dinh dưỡng. Sản phẩm của quá trình oxy hĩa chất béo làm cho bề mặt miếng cá phi lê bị biến sang màu vàng hoặc nâu sẫm. Thêm vào đĩ một số sản phẩm của quá trình oxy hĩa chất béo như aldehyde, keton, và các hợp chất dễ bay hơi khác làm cho sản phẩm cĩ mùi khĩ chịu, cĩ tính độc gây mất an tồn cho người tiêu dùng. Quá trình oxy hĩa diễn ra ngay sau khi đánh bắt, trong quá trình bảo quản nguyên liệu, chế biến và bảo quản sản phẩm (Hồ Bá Vương, 2013). Cá nục thuơn cĩ tên tiếng Anh là: Layang scad, tên khoa học: Decapterus macrosoma. Cá nục thuơn được phân loại theo bảng 1.13 như sau:
Phân loại:
Bảng 1.3. Phân loại khoa học của cá nục thuơn (Decapterus macrosoma) (Bleeker,
1851) Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Perciformes Họ: Carangidae Giống: Decapterus
Lồi: Decapterus macrosoma
Đặc điểm:
Cá cĩ chiều dài 17,6 - 35cm, 9 gai vây lưng, 338 tia vây lưng mềm, 3 gai hậu mơn, 27 - 30 đốt sống. Thân hình thoi dài, hơi dẹp bên. Chiều dài thân bằng 5,1 - 5,8 lần chiều cao thân, bằng 3,5 - 4,0 lần chiều dài đầu. Mõm tương đối dài, nhọn. Chiều dài mõm lớn hơn đường kính mắt. Đường bên hồn tồn, khi cá cịn nhỏ đoạn thẳng
đường bên ngắn hơn đoạn cong, và cá lớn ngược lại. Vây lưng dài, thấp. Phần lưng màu xanh xám, phần bụng màu trắng.
Phân bố:
Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Indonexia, Philipin, Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam. Ở Việt Nam, cá phân bố chủ yếu ở Vịnh Bắc Bộ, vùng biển miền Trung và Đơng, Tây Nam Bộ.
Thành phần khối lượng và thành phần hĩa học của cá nục thuơn:
Bảng 1.4 . Thành phần khối lượng (%) của cá nục thuơn (Vũ Thị Quyên, 2014)
Thịt Đầu Xương Vây Nội tạng
55,65 ± 0,2 18,75 ± 0,1 11,4± 0,1 5,46± 0,1 8,14± 0,1 Cá nục thuơn cĩ tỷ lệ phần ăn được cao chiếm 55,56 %, đây là lồi cá chiếm sản lượng hằng năm lớn, giá thành rẻ nên được sử dụng phổ biến trong cuộc sống hằng ngày. Hơn nữa qua thống kê cá nục thuơn cĩ thành phần đạm chiếm trên 20% so với khối lượng tươi, cao hơn so với các lồi cá khác như cá bớp, cá mối (Nguyễn Trọng Cẩn, 2006).
Bảng 1.5. Thành phần hĩa học (%)của cá nục thuơn (Vũ Thị Quyên, 2014)
Protein Lipid Tro Ẩm NNH3 Naa Nts
20,47 1,13 3,05 75,35 0,02 0,38 3,28
Theo nghiên cứu của Vũ Thị Quyên (2014) cho thấy cá nục thuơn cĩ tỷ lệ ăn được cao, thành phần hĩa học tương đương với thành phần hĩa học của cá nục được thống kê bởi Nguyễn Trọng Cẩn (2006).
1.4.2. Hạn chế oxy hĩa chất béo thịt cá
Để hạn chế quá trình tự oxy hĩa chất béo diễn ra, sản phẩm cần được bao gĩi để tránh tiếp xúc với oxy cũng như ngăn khơng cho tiếp xúc với ánh sáng. Cơ chế của quá trình quang oxy hĩa là do sự tương tác giữa acid béo khơng no với nguyên tử oxy để tạo thành hợp chất hydroperoxyde khơng thơng qua con đường tạo thành các gốc tự do. Thêm vào đĩ sự cĩ mặt của ánh sáng và đặc biệt là tia cực tím sẽ thúc đẩy quá trình quang oxy hĩa chất béo. Do đĩ, việc bao gĩi thực phẩm nhằm tránh cho thực phẩm tiếp xúc với ánh sáng mặt trời và các nguồn phát sáng khác sẽ hạn chế được quá trình oxy hĩa diễn ra.
Một số enzyme cĩ khả năng thúc đẩy quá trình oxy hĩa chất béo, đặc biệt là họ enzyme lipoxygenases. Đây là các enzyme cĩ chứa ion sắt và chúng cĩ khả năng gây
xúc tác giữa phân tử oxy và acid béo khơng no cĩ chứa các nhĩm cis, cis- 1,4pentadiene trong cấu trúc phân tử để tạo thành các hợp chất hydroperoxydes.
Nhiệt độ và thời gian là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ oxy hĩa acid béo và chất béo. Cường độ oxy hĩa chất béo tăng khi nhiệt độ và thời gian tăng. Một số nghiên cứu cho thấy quá trình oxy hĩa chất béo vẫn tiếp tục diễn ra khi các sản phẩm thủy sản được bảo quản đơng lạnh. Nhiệt độ bảo quản càng thấp sẽ hạn chế được sự oxy hĩa lipid, kéo dài thời gian bảo quản. Tuy nhiên, khi giảm nhiệt độ bảo quản xuống sẽ làm tăng chi phí sản xuất, tăng giá thành sản phẩm. Do đĩ, cần phải nghiên cứu để chọn nhiệt độ bảo quản thích hợp, thỏa mãn được đồng thời hai yêu cầu là đảm bảo về mặt chất lượng và chấp nhận được về mặt chi phí sản xuất.
Việc nghiên cứu áp dụng các phương pháp bao gĩi mới trong chế biến và bảo quản các sản phẩm thủy sản cũng được nghiên cứu ứng dụng nhiều trên thế giới. Mục đích là hạn chế những biến đổi khơng cĩ lợi diễn ra trong quá trình chế biến và bảo quản, từ đĩ kéo dài thời hạn bảo quản của sản phẩm. Hai phương pháp hiện đang áp dụng rộng rãi trong sản xuất là bao gĩi hút chân khơng và bao gĩi cĩ sự điều chỉnh thành phần khí quyển. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng khi sử dụng hai phương pháp bao gĩi này kết hợp với bảo quản ở nhiệt độ thấp sẽ giữ được chất lượng của sản phẩm thủy sản tốt hơn và thời gian bảo quản dài hơn.
Ngồi ra, để hạn chế sự oxy hĩa acid béo và chất béo diễn ra trong quá trình chế biến và bảo quản các sản phẩm thủy sản, các chất chống oxy hĩa thường được sử dụng. Các chất chống oxy hĩa bao gồm các chất chống oxy hĩa tự nhiên và các hợp chất hĩa học như acid ascorbic, vitamine E, BHA, BHT và các hợp chất phosphate. Các chất chống oxy hĩa cĩ nguồn gốc tự nhiên thường là các hợp chất phenol, được tách chiết từ thực vật, các loại rau, củ, quả…được chứng minh cĩ hiệu quả rất tốt trong việc hạn chế sự oxy hĩa chất béo của các sản phẩm thủy sản (Hồ Bá Vương, 2013).
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, hĩa chất và phương pháp phân tích
2.1.1. Nguyên vật liệu
Củ tỏi (Allium sativum L) dùng trong nghiên cứu này là tỏi khơ được mua trực tiếp tại thơn Thái An, xã Vĩnh Hải, huyện Ninh Hải, tỉnh Ninh Thuận. Tỏi sau khi mua được bảo quản ở nơi khơ ráo, thống mát dùng cho quá trình thí nghiệm.
Hình 2.1. Củ tỏi Phan Rang được dùng trong nghiên cứu này
Cá nục thuơn (Decapterus macrosoma) dùng trong nghiên cứu này cĩ kích cỡ trung bình 15 con/kg, được mua tại cảng Hịn Rớ, thành phố Nha Trang. Cá sau khi mua được bảo quản lạnh bằng nước đá trong thùng cách nhiệt styrofoam rồi được vận chuyển nhanh về phịng thí nghiệm trường Đại học Nha Trang trong vịng 1 giờ. Tại phịng thí nghiệm, cá được tiến hành phi lê tách lấy phần thịt đưa đi xay nhỏ bằng máy xay thịt (TA57D, Italia). Thịt cá xay này được dùng để thử nghiệm ảnh hưởng của dịch chiết từ củ tỏi đến khả năng chống lại sự oxy hĩa lipid trong cơ thịt cá nục xay trong quá trình bảo quản lạnh.
2.1.2. Hĩa chất
Hĩa chất sử dụng trong nghiên cứu này là loại đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích hĩa học, được mua từ cơng ty Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ; cơng ty Wako, Nhật Bản; cơng ty Labo chemie, Ấn Độ; cơng ty Merck, Đức; cơng ty hĩa chất Guang hua, Trung Quốc.
2.1.3. Phương pháp phân tích
2.1.3.1. Xác định hàm lượng hợp chất phenol và flavonoid tổng số
Hàm lượng hợp chất phenol tổng được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một vài thay đổi nhỏ được trình bày cụ thể như sau: Tĩm tắt: Chính xác 0,1 ml dịch chiết đã được pha lỗng tới nồng độ thích hợp được trộn với 0,4 ml nước cất, sau đĩ thêm 1 ml thuốc thử Folin – Ciocalteu’s 0,2 N và cuối cùng thêm 2,5 ml Na2CO3 7,5%. Hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ phịng trong tối, sau đúng 30 phút, độ hấp thu quang học của hỗn hợp phản ứng được đo trên máy quang phổ kế ở bước sĩng 765 nm (Specphotometer, Cary 50, Varian, Australia). Hàm lượng polyphenol tổng được tính tốn từ đường chuẩn acid gallic. Kết quả báo cáo cuối cùng là mg acid gallic tương đương (GAE)/g chất khơ.
Hàm lượng flavonoid tổng được xác định theo phương pháp của Quettier và cộng sự (2000) với một vài hiệu chỉnh nhỏ được trình bày cụ thể như sau:
Tĩm tắt: Chính xác 0,5 ml dịch chiết đã pha lỗng đến nồng độ thích hợp, sau đĩ thêm 0,5 ml AlCl3 2% hịa tan trong ethanol.Các mẫu được ủ 60 phút ở nhiệt độ phịng. Hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thu quang học ở bước sĩng ở 420 nm (Specphotometer, Cary 50, Varian, Australia). Hàm lượng flavonoid tổng được tính tốn từ đường chuẩn sử dụng Quercetin. Kết quả cuối cùng được báo cáo là µg Quercetin /ml.
2.1.3.2. Xác định hoạt tính chống oxy hĩa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết được xác định theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002) với một vài hiệu chỉnh nhỏ được trình bày cụ thể ở phụ lục1.
2.1.3.3. Xác định hoạt tính chống oxy hĩa dựa vào tổng năng lực khử
Năng lực khử được xác định theo phương pháp của Oyaizu (1986) với một vài hiệu chỉnh nhỏ được trình bày cụ thể như sau:
Mơ tả: Cho vào ống nghiệm 0,2 - 0,5 ml mẫu cần đo tiếp đĩ cho 0,5 ml K3Fe(CN)6 1% bổ sung tiếp 0,5- 0,8 ml dung dịch đệm (pH = 6,6) cho đủ 1,5 ml. Hỗn hợp được đem ủ ở 500C trong 20 phút.
Sau đĩ ta bổ sung vào ống nghiệm 0,5 ml CCl3COOH 10%. Tiếp tục bổ sung từ từ 2 ml nước cất và 0,4 ml FeCl3 0,1%. Tương tự đo khử gốc tự do DPPH ta tiến hành làm mẫu đối chứng nhưng khơng cho mẫu đo mà thay bằng dung dịch đệm.
Khả năng khử của hỗn hợp được đo độ hấp phụ ở bước sĩng 700nm trên thiết bị UV-Vis mini 1240. Mỗi mẫu tiến hành đo lặp lại 3 lần.
2.1.3.4. Xác định hoạt tính chống oxy hĩa lipid bằng phản ứng Fenton trong hệ Lipid/FeCl2/H2O2
Hoạt tính chống oxy hĩa lipid của dịch chiết từ củ tỏi bằng phản ứng Fenton trong hệ Lipid/FeCl2/H2O2 theo phương pháp của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo (2003) được trình bày cụ thể ở phụ lục 1.
2.1.3.5. Xác định chỉ số peroxide (PV)
Chỉ số peroxide được xác định theo phương pháp của Richard và Hultin (2002) với một vài sự thay đổi nhỏ được trình bày cụ thể như sau:
Dựa trên sự hình thành phức chất cĩ màu vàng nâu giữa hydroperoxyde với ferric thiocyanate. Màu sắc của phức chất được đo trên máy quang phổ kế ở bước sĩng 500 nm. Kết quả được thể hiện bằng micromol lipid hydroperoxyde trong 1g cơ thịt cá và được tính tốn dự vào đường chuẩn xây dựng từ cumene peroxyde.
Tĩm tắt: Cân khoảng 4.5 – 5,5g (mẫu đã xay nhỏ) đồng hĩa 13500 vịng trong 2 phút với 11ml chloroform/methanol (2/1:v/v). Hỗn hợp đồng hĩa lọc qua giấy lọc Whatman No.1. Lấy 7 ml dịch lọc và 2ml NaCl 0.5% rồi đem đi votex ở tốc độ trung bình trong 30 giây. Sau đĩ đưa đi ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 3000 vịng /g trong 3 phút . Hỗn hợp tách làm 2 lớp, lấy 3ml dịch lớp dưới và 2 ml hỗn hợp dung dịch chloroform/methanol (2/1:v/v), 25 µl amonium thiocyanate 30% (w/v), 25 µl FeCl2 . Rồi đem đi votex, ly tâm lạnh ở 4oC 5000 vịng trong 10 phút. Hỗn hợp để yên trong 20 phút ở nhiệt độ phịng rồi đem đo UV-VIS.
2.1.3.6. Xác định chỉ số TBARS
Chỉ số TBARS được xác định theo phương pháp của Uchiyama và Mihara (1978) với một vài sự thay đổi nhỏ được trình bày cụ thể như sau:
Cân khoảng 0.5 g thịt cá đã được xay nhuyễn trộn với 4.5 ml KCl 1.15%. Đem đi đồng hĩa, lấy dịch đồng hĩa cho thêm 0.3 ml H3PO4 1% rồi đậy nắp lắc đều. Sau đĩ, cho 1 ml TBA 0.6%, tiếp đến cho 3 giọt BHT pha trong methanol, rồi đậy nắp kín đêm đi votex. Tiếp đến cho vào bể ủ nhiệt ở 95oC trong 45 phút . Sau đĩ làm nguội ở nhiệt độ phịng, cho thêm 4 ml butanol đậy nắp kín dem đi votex, rồi ly tâm ở 5000 vịng trong 10 phút, đem đi xác định độ hấp thu quang học ở bước sĩng 535 và 520 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia). Kết quả được báo cáo là mg MAD/100g thịt cá. Mỗi phân tích được thực hiện lặp lại hai lần. Kết quả báo cáo là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
2.1.3.7. Xác định tổng nitơ bazơ bay hơi
Phương pháp xác định tổng nitơ bazơ bay hơi (theo AOAC 029.03-1990). Phương pháp này áp dụng trong trường hợp hàm lượng TVB-N từ 5mg/100g đến 100mg/100g, được trình bày cụ thể như sau:
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị mẫu: Lấy chính xác 100g mẫu đã nghiền, thêm vào 200ml acid trichloroacetic rồi trộn trong máy để đơng nhất, sau đĩ lọc bằng giấy lọc whatman. Dung dịch lọc cĩ thể giữ được vài ngày ở 2-6oC.
- Chuẩn bị cốc hứng: Cốc hứng chứa 10 ml acid boric 4% và 0.04 chỉ thị hỗn hợp (metyl đỏ 0.2% và metylen xanh 0.1% (tỉ lệ 1/1). Đặt cốc hứng dưới đầu ống sinh hàn sao cho đầu ống ngập trong dung dịch trong cốc hứng.
- Chưng cất: Lấy 25 ml dung dịch chiết rút ở trên, cho vào thiết bị chưng cất, thêm vào vài giọt chỉ thị phenolphtalein 1%, cuối cùng thêm 6 mlNaOH 10% cho đến khi dung dịch cĩ màu hồng, nhanh chĩng đậy kín thiết bị rồi tiến hành chưng cất. Dung dịch rơi từ đầu ống sinh hàn được hấp thụ bởi acid boric ở trong cốc hứng, sau 30 phút quá trình chưng cất kết thúc (thể tích cốc hứng khoảng 50ml). Đầu ống sinh hàn được nhấc lên và rửa sạch bằng nước cất, nước rửa cũng được hứng vào cốc hứng . Dung dịch trong cốc chuyển sang mầu xanh.
- Chuẩn độ: Dung dịch trong cốc hứng được đem chuẩn độ bằng HCl 0.1 N đến khi dung dịch trong cốc hứng vừa chuyển sang màu hồng/xám nhạt thì dừng.
- Tính kết quả:
Hàm lượng TVB-N được tính theo cơng thức:
TVB-N = (mg/N/100g)
a : Thể tích HCl 0.1 N dùng trong chuẩn độ mẫu thử a’: Thể tích HCl 0.1 N dùng trong chuẩn độ mẫu trắng b : Đương lượng mol của HCl
2.1.3.8. Phân tích định tính hĩa thực vật nhận diện các hoạt chất chống oxy hố trong dịch chiết từ củ tỏi
Phân tích định tính hĩa thực vật nhận diện các hoạt chất chống oxy hố trong dịch chiết từ củ tỏi theo phương pháp của Harborne (1998) được trình bày cụ thể ở phụ lục 2.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp tiếp cận các nội dung của đề tài và sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Cách tiếp cận tổng quát các nội dung nghiên cứu của đề tài được trình bày ở Hình 2.3.
Hình 2.3. Sơ đồ tiếp cận tổng quát các nội dung đề tài
Với cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài như trên, sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát cho các nội dung của nghiên cứu này được trình bày trên sơ đồ thí nghiệm Hình 2.4.
Củ tỏi khơ Phan Rang
Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của từng yếu tố đến hoạt tính chống oxy hĩa của dịch chiết từ củ tỏi