ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.3. Phương pháp làm tiêu bản NST
2.2.3.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Thiết bị: bể ổn nhiệt, tủ lạnh, cân điện tử, kính hiển vi, máy ảnh. Dụng cụ: lam kính, lamen, dao lam, kim mũi nhọn, giấy thấm…
Hóa chất: etanol 90o, acetic acid 45%, aceto carmine 2%, fucshin, HCl 1N, nước cất.
Thu mẫu
Cố định bằng dung dịch Clarec
Nhuộm mẫu
Nén tiêu bản
Quan sát tiêu bản
2.2.3.2 Quy trình làm tiêu bản nén
Bao gồm các bước sau:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Khi thu mẫu ta quan tâm đến thời gian thu mẫu, độ dài của rễ. Thời gian thu mẫu có vai trò quan trọng vì đa số các thí nghiệm thu được đều cho thấy số tế bào phân chia vào các giờ khác nhau trong ngày là không giống nhau. Thời gian thu mẫu thích hợp ở hành là 8-10h, thài lài tím là 11-12h.
Với bao phấn thì chúng tôi tiến hành thu hái hoa, thời gian thích hợp là từ 11-13h, sau đó dùng panh và kim mũi nhọn tách lấy bao phấn non có màu trắng để sử dụng trong thí nghiệm.
Bước 2: Cố định mẫu
Cố định mẫu là cách giết chết tế bào một cách nhanh chóng nhằm giữ nguyên cấu trúc của tế bào và giúp cho tế bào bắt màu thuốc nhuộm tốt hơn.
Cách tiến hành: Cho mẫu vào dung dịch clarec (3 etanol: 1 acetic acid) trong 2-24h.
Chú ý: Mẫu sau khi cố định cần được rửa lại bằng etanol 700 và sau đó bảo quản mẫu trong etanol 700 ở điều kiện lạnh để dùng làm tiêu bản dần.
Bước 3: Thủy phân
Thủy phân mẫu trước khi nhuộm giúp cho mẫu mềm, dễ dàn đều và nhanh chóng bắt mầu thuốc nhuộm hơn.
Cách tiến hành: Mẫu bảo quản trong etanol 700 ở điều kiện lạnh ra và rửa sạch etanol bằng nước cất trong 5-10 phút. Sau đó thủy phân mẫu trong HCl 1N ở 600C trong 5-10 phút.
Bước 4: Nhuộm mẫu
Dưới kính hiển vi quang học, tế bào thường trong suốt và tương đối đồng nhất. Vì thế bằng thuốc nhuộm fuchsin hoặc aceto carmin, chúng ta có thể quan sát rõ hoạt động của NST ở tế bào thực vật dưới kính hiển vi.
Cách tiến hành: Rễ khi thủy phân xong được rửa lại bằng nước cất và nhuộm trong dung dịch basic fuchsin.
Bước 5: Làm tiêu bản nén
Mục đích: dàn mỏng mẫu vật và làm tung các NST để quan sát các bất thường NST.
Sau khoảng 20-30 phút thì mẫu bắt màu và chúng ta có thể tiến hành làm tiêu bản nén. Để mẫu đã nhuộm lên lam kính (đối với rễ thì phải loại bỏ chóp rễ và cắt một lát mỏng) nhỏ một giọt thuốc nhuộm rồi đậy lamen hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn 5-10 giây để làm mềm mẫu, đuổi bọt khí và có tác dụng nhuộm phụ nén mẫu.
Bước 6: Quan sát tiêu bản
Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi sử dụng vật kính 10X sau đó quan sát ở các vật kính 40X và 100X. Nếu quan sát ở vật kính 100 thì phải dùng dầu kính.
Đếm số lượng tế bào đang phân chia ở các kì trên mỗi tiêu bản để xác định chỉ số phân bào.
Đếm số lượng và phân loại các dạng đột biến trên mỗi tiêu bản để xác định số loại và tần số bất thường NST.
Chụp ảnh những đột biến điển hình, tiêu bản đẹp