- Dưới vùng DP: cũng bao gồm 2 bộ gien ,1 bộ chứa gien giả DPA2 và
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.3. Phương pháp tạo bộ sinh phẩm chẩn đốn HLA bằng kỹ thuật độc tế bào Terasaki:
tế bào Terasaki:
Tiến hành trên đối tượng là sản phụ sau sanh. Trên lý thuyết thì cĩ thể phát hiện được kháng thể kháng HLA trong máu sản phụ, vì thời gian thai nhi sống trong cơ thể người mẹ khá lâu, nên cĩ đủ khả năng kích thích cơ thể người mẹ sinh kháng thể kháng HLA của người con, mà chúng nhận được từ cha. Đồng thời đặc tính kháng nguyên - kháng thể khơng phức tạp như ở người được truyền máu nhiều lần. [31], [80], [94]
Máu lấy từ sản phụ, khơng lấy máu qua đường tĩnh mạch, vì việc lấy máu qua đường tĩnh mạch với số lượng tương đối nhiều (trên 20 ml cho mỗi mẫu), là việc khĩ thực hiện trong điều kiện nước ta. Trong khi máu sau khi sổ nhau theo đường âm đạo thì cĩ thể lấy nhiều, đồng thời khơng ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu.
Trên những đối tượng đạt yêu cầu cĩ thể tiến hành lấy máu. Chờ sau khi nhau được sổ ra khỏi âm đạo.
Dùng cốc thủy tinh 50 ml hứng máu chảy ra.
Đặt ở nhiệt độ khoảng 4-6 oC (trong tủ lạnh), khoảng 6-8 giờ. Dùng que nhẹ nhàng bốc tách cục máu đơng.
Hút huyết thanh bằng pipette Pasteur, sang qua ống nghiệm khác, tùy vào thể tích huyết thanh quyết định chọn ống nghiệm.
Nếu trong quá trình chiết tách huyết thanh cịn lẫn nhiều hồng cầu, nên quay ly tâm tốc độ 3.000 vịng /phút trong 5 phút để loại bỏ hồng cầu.
Lấy 1ml huyết thanh sau khi chiết tách, cho vào ống eppendorf. Lượng huyết thanh này sẽ được sử dụng để phân tích (screening) tìm kháng huyết thanh.
Tất cả ống huyết thanh và ống eppendorf, được ghi mã số và bảo quản trong tủ lạnh âm 80 oC.
Với số lượng máu 50ml, cĩ thể chiết tách được khoảng 30 ml huyết thanh; sử dụng 1 ml cho việc nghiên cứu cịn khoảng 25 ml được bảo quản ở nhiệt độ - 80oC (4ml: trừ hao hụt, cĩ thể trong quá trình làm bị thất thốt).
Khi cĩ kết quả, sử dụng kháng huyết thanh này cho bộ sinh phẩm xác định kháng nguyên HLA. Mỗi lần sử dụng 1μl cho mỗi mẫu xét nghiệm, với số lượng 25 ml cĩ thể tiến hành xét nghiệm được khoảng 25.000 mẫu. Như vậy, sẽ tiết kiệm rất nhiều và hiệu giá kháng thể chống HLA cũng ít thay đổi.
Ở một số nước, khi tiến hành dị tìm kháng thể, mẫu huyết thanh nào cĩ kết quả dương tính thì cĩ thể sử dụng làm kháng huyết thanh chẩn đốn. Lúc bấy giờ, người ta mới lấy máu sản phụ sau sanh, qua đường tĩnh mạch một số lượng lớn (khoảng 250-500ml máu). Vì sợ ảnh hưởng đến nồng độ kháng thể trong máu, do hệ thống mạng idiotype hình thành trong cơ thể người mẹ sau khi sanh, làm hiệu giá kháng thể giảm dần.[20], [48][70][94].
Phịng thí nghiệm thường cho kiểm chứng lại hiệu giá kháng thể, trước khi sử dụng làm huyết thanh chẩn đốn.
Các bước tiến hành: kỹ thuật độc tế bào.
Chuẩn bị khay:
• Khay Terasaki
• Nhỏ paraffin lỏng đều mỗi giếng để tránh bay hơi huyết thanh
• Đặt 1μl huyết thanh lấy từ máu sản phụ vào giếng (một giếng là một mẫu huyết thanh máu sản phụ sau sanh)
• Cho chứng dương: sử dụng kháng thể kháng tế bào lympho: ALS (anti lympho serum) làm chứng dương và sử dụng PBS làm chứng âm.
• Bảo quản khay trong tủ -350C
Chuẩn bị mẫu tế bào lympho từ người cho trong panel:
• Đặt 2ml dung dịch Ficoll vào ống nghiệm.
• Đưa máu nhẹ nhàng vào ống nghiệm chứa Ficoll, tránh để máu rớt xuống đáy ống nghiệm.
• Quay ly tâm 3000vịng/phút trong 15phút
• Hút dịng bạch cầu chiết tách được từ ống nghiệm ban đầu sang ống nghiệm khác.
• Rửa 2 lần:
Lần đầu, rửa trong dung dịch PBS (khi cho dung dịch PBS vào, trộn đều tế bào với dd PBS), quay ly tâm 2500 vịng/phút trong 10phút
Lần thứ hai rửa bằng dung dịch 50% PBS + 50% MEMS, trộn đều, ly tâm 2000 vịng/phút trong 7 phút.
• Đếm tế bào, rồi đưa về dung dịch chứa 5000 tế bào trong 1μl với MEMS.
Tiến hành:
• Đặt 1 μl dung dịch tế bào vào các giếng trong khay Terasaki
• Ủ nhiệt độ phịng 30 phút
• Cho 5 μl bổ thể thỏ vào các giếng
• Ủ nhiệt độ phịng 60 phút
• Cho 0,5 μl dung dịch eosin 5% (pha bằng PBS) vào các giếng
• Đọc kết quả dưới kính hiển vi soi ngược vật kính 40
• Kết quả dương tính khi số lượng tế bào chết trên 60%.[18], [25], [49][63][95]
Chuẩn bị bổ thể thỏ:
Lấy máu từ động mạch cảnh của 10 con thỏ. Tốt nhất, nên chọn thỏ lơng xám vì trong huyết thanh của giống thỏ này, nồng độ bổ thể cao hơn giống thỏ khác. Huyết thanh sau khi tách từ máu thỏ, trộn đều lại và pha lỗng tỷ lệ ½ với
dung dịch PBS. Ở nồng độ này, thích hợp cho phản ứng tối ưu xảy ra, làm quá trình gây tổn thương màng tế bào lympho cao nhất. [49][85][86]
Quá trình thực hiện với tồn bộ lympho của dàn panel.
Hình 2.11: Khay TERASAKI [45]
“Nguồn: Terasaki P.I, 1964”