- Dưới vùng DP: cũng bao gồm 2 bộ gien ,1 bộ chứa gien giả DPA2 và
1.9.2 Kỹ thuật PCR Thuận lợi:
Thuận lợi:
1/ Cĩ thể sử dụng máu tồn phần, kể cả những máu của bệnh nhân đang được hĩa trị hoặc đang được chiếu xạ.
2/ Hố chất sử dụng trong quá trình khuếch đại (amplification) và kỹ thuật để phát hiện, được chuẩn bị sẵn.
3/ Kỹ thuật DNA based typing cĩ thể phát hiện được những kiểu gien trong khi đĩ huyết thanh chẩn đốn chỉ cĩ thể phát hiện được kiểu hình. Chính vì thế trong kỹ thuật huyết thanh chẩn đốn cĩ những mặt hạn chế của nĩ, trong việc xác định chính xác phân tử HLA.
Bằng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu về gien nhĩm HLA. Đặc biệt đối với HLA lớp II, hơn 10 năm nghiên cứu người ta nhận định cĩ khoảng 14 – 17 nonallelic của vùng HLA-D bao gồm: gien mã hố cho DR, DP, DQ, DM, DN và DO.
Cĩ 2 kỹ thuật PCR thường được áp dụng để xác định kiểu gien của phân tử HLA: PCR-SSO (Polymerase chain reaction -sequence specific oligo nucleotides primers) và PCR-SSP (Polymerase chain reaction - sequence specific primers).
Ngày nay, người ta đã phát triển kỹ thuật này lên và cĩ thể xác định HLA- DR tương đối nhanh từ khâu chiết tách DNA đến khâu nhận định HLA-DR qua kỹ thuật PCR-SSO được làm trên stick của hãng Dynal.
Kỹõ thuật thực hiện nhanh, đơn giản, và quan trọng nhất là độ chính xác của nĩ.
Nguyên tác kỹ thuật:
Dựa vào 3 qui trình chính:
- Qui trình khuếch đại DNA đích. - Qui trình gắn kết trên que (probe ). - Qui trình lên màu.
Phần HLA master mix chứa những cặp primer cho việc mồi exon số 2 và những cặp primer để tách exon số 3. (10% glycerol, 100mM KCL, 0.001% dATP, dCTP, dGTP, dUTP, biotinylated primers, 0.01% AmpliTaq (Taq polymerase), 0.05% sodium azide).
Những mẫu chứa DNA và những chất phản ứng được làm nĩng ở nhiệt độ 95oC để tách chuổi đơi của phân tử DNA và tạo điều kiện để phân tử DNA tiếp xúc với primers. Khi làm lạnh các primers sẽ tác động đến những chuổi DNA đích. Những enzym DNA polymerase (Taq: thermos aquaticus) chịu nhiệt sẽ tái tổ hợp các deoxynucloside triphosphates (dNTPs) bao gồm deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxycytidine và deoxyuridine, dựa vào khuơn mẫu DNA, đã được mồi bằng những primers tạo thành những chuổi DNA theo mẫu đích. Quá trình lập lại nhiều lần theo chu trình nhiệt. Kết quả quá trình khuếch đại theo kiểu nhân đơi chúng ta sẽ thu được một lượng lớn DNA đích so với ban đầu (theo lý thuyết chúng cĩ thể nhân lên gấp tỷ lần so với lượng DNA ban đầu).
Các chuổi DNA sau khi được khuếch đại sẽ được các enzym cắt thành những chuổi đơn, chúng sẽ được gắn kết đặc hiệu vào những que oligonucleotide (oligonucleotide probe) và với những điều kiện nghiêm ngặt cho quá trình lai (hybridization) chúng tạo những phản ứng đặc hiệu.
(SA-HRP) conjugate được thêm vào, streptavidin horseradish peroxidase sẽ gắn kết lên que nơi cĩ các phân tử DNA đích gắn vào. Sau đĩ, rửa lại, nhằm loại bỏ các conjugate thừa, tiếp tục cho H2O2 (hydrogen peroxide) và tetra- methylbenzidine (TMB) phản ứng tạo màu diễn ra. Phản ứng sẽ ngừng khi rửa nước (Dựa vào kỹ thuật phát hiện HLA của hãng Dynal: Dynal RELITM SSO HLA-A, B, DR).
Dùng que mẫu để xác định phân tử HLA tương ứng tùy vị trí vệt màu xuất trên que.
Quá trình chiết tách DNA:
Trong kỹ thuật xác định HLA người ta thường dùng tế bào bạch cầu.
Với kỹ thuật Buffy Coat, để lấy tế bào bạch cầu: sử dụng 4ml máu tồn phần sau khi được chống đơng với EDTA, quay ly tâm 2500 vịng trong 10 phút, hút khoảng 200μl (ứơc lượng khoảng 5 x 106 lymphocytes) phần lớp trắng nằm trên ống máu sau ly tâm. DNA sau khi được chiết tách sẽ được xác định nồng độ bằng cách, đo với máy quang phổ kế DNA, bước sĩng đo 260 -280nm. Nếu liều lượng chiết tách được trong khoảng 13,3 – 200 ng/μl, thì đạt yêu cầu và cĩ thể sử dụng để nhân lên ( amplification).
(Dựa vào kỹ thuật: QIAamp DNA Blood Mini Spin and vacuum procedures, hãng QIAGEN).
Xác định HLA–DR kỹ thuật PCR- SSP (Polymerase Chain Reaction with Sequence-specific Primers)
Nguyên tắc kỹ thuật:
Dùng phức hợp primers bao gồm nhiều loại primers để xác định kiểu hình phân tử HLA-DR đặc biệt trong giai đoạn đầu của quá trình khuếch đại DNA. Từ đĩ, với hoạt động đặc hiệu của những pimers mồi sẽ cho chúng ta những đoạn DNA đặc thù cho từng kiểu hình của người cần xác định HLA. Cuối cùng
dùng phương pháp điện di trên thạch hoặc kỹ thuật huỳnh quang để định HLA của cá thể cần chẩn đốn.
Hình 2.7: Nguyên lý kỹ thuật PCR-SSO trên que thử “Nguồn: Trần Minh Hiếu, 2005” [5]
Quá trình chiết tách DNA:
Đầu tiên chúng ta dùng tube 50ml, sau đĩ cho vào 40ml dung dịch hủy hồng cầu (0.32M sucrose/1% v/v Triton X-100/5mM Mg Cl2. 6H2O/12mM Tris HCl, pH 7.5), cộng với 5-10ml máu đựoc chống đơng với EDTA hoặc máu được chống đơng với heparin. Trộn nhẹ nhàng trong 1 phút. Sau đĩ quay ly tâm 1.200 vịng trong 10 phút ở nhiệt độ phịng để tách tế bào cĩ nhân ra.
Chúng ta tiếp tục cho 20ml dung dịch hủy hồng cầu, trộn nhẹ nhàng trong 1 phút và ly tâm 1.200 vịng trong 10 phút. Đổ hết dịch phía trên và dốc ngược tube đặt trên giấy thấm để loại bỏ nước trong ống càng nhiều càng tốt.
Cho vào tube 160μl 5 x proteinase K buffer (0.375 M NaCl /0.12 M EDTA pH 8.0, 40μl proteinase K (10mg/ml), 40 μl 20% sodium dodecyl sulfate
(SDS) và 300μl H2O, thể tích cuối cùng đạt được khoảng 800μl. Sau đĩ, trộn đều và chuyển sang tube1.5 ml.
Ủ và lắc nhẹ ở nhiệt độ 37oC qua đêm hoặc 55oC/ 2 giờ, trong trường hợp này thì sau khi ủ một giờ, cho thêm 20μl proteinase K.
Thêm 200μl 6M NaCl, lắc mạnh trong 15–30 giây, quay ly tâm 13.000 vịng trong 10 phút để cơ đọng chất tủa của protein. Sau đĩ, tiếp tục vớt phần nổi bên trên sang ống 1,5ml và quay ly tâm 13.000 vịng trong 10 phút để cơ đọng chất tủa của protein. Sau đĩ tiếp tục vớt phần nổi bên trên sang ống 1,5ml và quay ly tâm 13.000 vịng trong 5 phút.
Dung dịch nổi cuối cùng được sang qua 2 tube 1,5ml, ước lượng mỗi tube sẽ được 450μl. thêm vào 900μl ethanol 99,5%. Quay ly tâm 13.000 vịng trong 5 phút, để ethanol bay hơi chúng ta sẽ thu được DNA khơ, cho vào 1ml TE buffer (10 mM Tris HCL, 7.5 /1mM EDTA).
Quá trình chiết tách DNA nhanh:
Kỹ thuật này cĩ thể chiết tách DNA trong vịng 30 phút.
Lấy 1ml máu chống đơng với EDTA. Lắc nhẹ và quay ly tâm 13.000 vịng trong 1 phút, chúng ta sẽ thu được tế bào cĩ nhân, rửa 1 lần với 1ml nước và 13.000 vịng trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi ở trên và cho vào 80μl 5 x proteinase K buffer (0.375M NaCl /0.12 M EDTA pH 8.0, 40μl proteinase K (10mg/ml), 20 μl 20% sodium dodecyl sulfate (SDS) và 240μl H2O, thể tích cuối cùng đạt được khoảng 400μl).
Ủ và lắc nhẹ tube ở nhiệt độ 55oC trong 15 phút.
Thêm 100μl 6M NaCl, lắc mạnh trong 15 giây, quay ly tâm 13.000 vịng trong 5 phút
Dung dịch nổi cuối cùng được sang qua tube 1,5ml. thêm vào 1ml ethanol 99,5%. Quay ly tâm 13.000 trong 5 phút, phần nổi ở trên được chuyển qua tube
1,5ml và được rửa với ethanol 70 % (để lạnh), quay ly tâm 13.000 vịng trong 1 phút, trút bỏ ethanol, để ethanol bay hơi chúng ta sẽ thu được DNA khơ, hịa tan DNA trong 50 – 200μl H2O, sau đĩ vortex trong 30 giây. Sử dụng 2μl DNA cho mỗi phản ứng PCR.
Qui trình khuếch đại với Primers:
Cĩ thể sử dụng các primers đặc thù cho từng kiểu hình của phân tử HLA-DR làm phản ứng mồi để khuếch đại chuỗi DNA đặc hiệu, cĩ nhiều primers cĩ thể sử dụng để tạo phản ứng mồi trong kỹ thuật PCR-SSP. Đánh giá quá trình khuếch đại bởi điện di Gel Agarose. Phát hiện vết chạy dưới đèn tử ngoại (UV) và chụp hình.
Nhận định kết quả:
Tất cả các primer mixes để xác định DR qua kỹ thuật PCR-SSP ( cụ thể DR4, DR1 sẽ được thử trong 400-800 phản ứng, khơng cĩ dương tính giả và âm tính giả, thường thì kỹ thuật này mức độ thất bại rất thấp khoảng 1%.