- Dưới vùng DP: cũng bao gồm 2 bộ gien ,1 bộ chứa gien giả DPA2 và
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2 Phương pháp tạo panel lympho bằng kỹ thuật PCR-SSO: * Chiết tách DNA:
* Chiết tách DNA:
Sử dụng 200 μl dung dịch bạch cầu để chiết tách DNA. DNA sau khi được chiết tách, xác định nồng độ của DNA bằng máy quang phổ kế, bước sĩng đo 260 -280nm. Nếu liều lượng chiết tách được trong khoảng 13,3 – 200 ng/μl, thì đạt yêu cầu, cĩ thể sử dụng để nhân lên (amplification). [14], [53]
* Quy trình khuếch đại:
Phần HLA master mix: dung dịch này chứa những cặp primer cho việc mồi exon số 2 và những cặp primer để tách exon số 3. (10% glycerol, 100mM KCL, 0.001% dATP, dCTP, dGTP, dUTP, biotinylated primers, 0.01% AmpliTaq (Taq polymerase), 0.05% sodium azide ).
Chu trình khuếch đại: 95oC trong 15 giây 60oC trong 45 giây 72oC trong 15 giây [53]
* Phản ứng lai (Hybridisation reaction):
Các chuỗi DNA sau khi được khuếch đại sẽ được các enzym cắt thành những chuỗi đơn, chúng sẽ được gắn kết đặc hiệu vào những que oligonucleotide (oligonucleotide probe), với những điều kiện nghiêm ngặt cho quá trình lai (hybridization) chúng tạo những phản ứng đặc hiệu.
* Qui trình phát hiện:
Sau khi rửa những hoạt chất thừa, streptavidin horseradish peroxidase conjugate được thêm vào, streptavidin horseradish peroxidase sẽ gắn kết lên que nơi cĩ các phân tử DNA đích gắn vào. Sau đĩ, rửa lại nhằm loại bỏ các conjugate thừa, tiếp tục cho H2O2 (hydrogen peroxide) và tetramethylbenzidine (TMB) phản ứng tạo màu sẽ diễn ra. Phản ứng sẽ ngừng khi rửa nước (Dựa vào kỹ thuật phát hiện HLA của hãng Dynal).
Dùng que mẫu để xác định phân tử HLA tương ứng tùy vị trí vệt màu xuất hiện trên que. [53]
Tiến hành phân tích HLA bằng kỹ thuật PCR–SSO, qui trình được thực hiện tại phịng thí nghiệm HLA, trường Đại học Louvain, Bỉ.
Thời gian thực hiện 1 tháng, tính từ ngày lấy máu cho đến khi cĩ kết quả HLA của 150 mẫu máu của người tình nguyện đạt tiêu chuẩn. Nghiên cứu chỉ thực hiện được 150 mẫu vì khả năng bảo trợ của Bỉ cĩ hạn, nên khơng thực hiện được 300 mẫu như ký kết ban đầu. 150 mẫu cịn lại, được bảo lưu ở -80oC, khi cĩ điều kiện sẽ tiếp tục tiến hành phân tích HLA[47][49][55][76][98]..
Sơ đồ2.3: Sơ đồ khuếch đại DNA qua máy luân nhiệt. Kỹ thuật PCR-SSO
Hình 2.9: Kết quả trên que thử HLA “PCR-SSO” sau khi được lên màu.