3.3.3.1. Xác định độẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. Nguyên tắc:
Khi sấy ở nhiệt độ cao (1050C) trong thời gian dài lượng nước trong nguyên liệu sẽ bay hơi dần và khi lượng nước bay hơi toàn bộ còn lại phần chất khô không bay hơi. Cân khối lượng trước và sau sấy, dựa vào sự chênh lệch khối lượng ta sẽ biết khối lượng nước trong vật liệu cần xác định độ ẩm.
Tiến hành: Cách tiến hành được trình bày trong phụ lục 1a.
Tính kết quả:
Độ ẩm nguyên liệu:
Trong đó: m1: Khối lượng cốc sấy
m2: Khối lượng cốc và mẫu tươi m3: Khối lượng cốc và mẫu sau sấy
3.3.3.2. Xác định protein bằng : phương pháp Kjeldahl Nguyên tắc:
Dùng H2SO4 đậm đặc phản ứng với nguyên liệu, khi đó, các chất hữu cơ bị oxy hóa. Nitơ của protein đã bị chuyển hóa thành NH3 dưới dạng muối amoni sulfate tan trong dung dịch. Đuổi NH3 trong dung dịch bằng NaOH và hơi nước, lượng NH3 thu được sẽ cho phản ứng với dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N. Định phân lượng H2SO4 còn dư sau phản ứng với NH3 bằng dung dịch NaOH 0,1N, từ đó, tính hàm lượng nitơ có trong mẫu nguyên liệu thí nghiệm.
Cách tiến hành: Xem phụ lục 1b Cách tính kết quả: c v V a X * 100 * * 96 , 5 * 00142 , 0 * = Trong đó:
X (%): hàm lượng protein trong mẫu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36 0,00142: số mg nitơ tương đương với 1ml H2SO4 0,1N
V (ml): số ml dung dịch mẫu pha loãng (100ml)
v: số ml dung dịch mẫu đem chưng cất ammoniac (25ml) c (g): khối lượng mẫu đem phân tích
5,96: Hệ số chuyển nitơ trong gạo
3.3.3.3. Xác định lipit bằng phương pháp Soxhlet Nguyên tắc:
Dùng axit clohydric hòa tan mẫu để giải phóng toàn bộ chất béo hấp thụ và liên kết trong mẫu, sau đó chiết chất béo bằng dung môi hữu cơ
Cách tiến hành: Xem phụ lục 1c
Cách tính kết quả:
Hàm lượng lipit (X) tính bằng % theo công thức
100 . ) ( ) ( 1 2 3 4 m m m m m X − − − = Trong đó: m - lượng cân (g)
m1 - khối lượng bình hứng có chất béo (g) m2 - khối lượng bình không (g)
m3 - khối lượng bình hứng mẫu trắng sau khi cất (g) m4 - khối lượng bình không của mẫu trắng (g)
Kết quả là trung bình cộng của hai lần xác định song song tính chính xác đến 0,01%.
Chênh lệch kết quả giữa 2 lần xác định không lớn hơn 0,02%.
3.3.3.4. Xác định gluxit bằng phương pháp Bertrand Nguyên tắc
Trong môi trường kiềm các đường khử dễ dàng khử đồng II thành đồng I theo phản ứng Fehling. Kết tủa đồng I oxit có màu đỏ gạch, có khả năng khử muối Fe3+ thành Fe2+ trong môi trường axit.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37 Fe2+ sinh ra có tính khử lại tác dụng với KMnO4 là chất oxy hóa nên dùng KMnO4 để chuẩn độ Fe2+ trong môi trường acid:
10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 5Fe2(SO4)3 + 8H2O Dựa vào lượng KMnO4 sử dụng ta có thể tính được lượng Cu2O và từ đó tính được lượng đường khử trong dung dịch bằng cách tra bảng tỉ lệ giữa dung dịch KMnO4 và đường khử của Bertrand.
Cách tiến hành: xem phụ lục 1d
Cách tính kết quả
Hàm lượng đường khử tính theo công thức X = a.V.100/ V1.m.1000 Trong đó :
X: hàm lượng đường khử tính theo %
a: số mg glucose tìm được khi tra bảng ứng với số mL KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu phân tích trừ đi số mL KMnO4 1/30N dùng để chuẩn độ mẫu không.
V: thể tích pha loãng mẫu (100mL)
V1: thể tích mẫu lấy đem xác định đường khử m: lượng mẫu đem phân tích
1000: hệ số đổi gam thành mg Hàm lượng gluxit tính theo công thức
Hàm lượng gluxit = đường khử * 0.9
3.3.3.5. Xác định hàm lượng vitamin D bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC
Nguyên tắc
Dựa vào pick của chất phân tích, so sánh với đường chuẩn, từ đó xác định được hàm lượng vitamin D của chất cần phân tích.
Cách tiến hành
-Đồng nhất mẫu.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38 KOH 80%, 40ml MeOH. Thủy phân ở 75oC trong 30 phút.
-Chiết 2 lần với n-hexan (50ml/lần)
-Lấy lớp hữu cơ và gộp dịch chiết 2 lần thêm NaCl 5% đến trung tính.
-Cho qua Na2SO4 khan, cô quay chân không ở 40oC. Hòa cặn bằng 2ml MeOH.
-Chạy HPLC với: detecter PDA bước sóng 265nm; cột Intertsil ODS 3; thể tích tiêm mẫu 50 mcl; tốc độ dòng 1,5ml/phút.
Cách tính kết quả
Phương trình đường chuẩn: Y= 148714x + 3054,5
R2 = 0,9976.
3.3.3.6. Xác định hàm lượng canxi bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử ASS. Nguyên tắc
Từ độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn, lập đường chuẩn thực nghiệm biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ canxi và tính toán nồng độ canxi trong dung dịch thử dựa vào đường chuẩn.
Cách tiến hành
Thiết bị: Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử có trang bịđèn cathod rỗng canxi, đầu đốt sử dụng ngọn lửa acetylen – không khí nén.
- Dung dịch lanthan clorid: Hòa than 26,7 g lanthan clorid heptahydrat trong HCl 0,125N thành 100,0 ml.
- Dung dịch polysorbat 80: pha loãng 100 ml polysorbat 80 với ethanol 96% (TT) thành 1000,0 ml.
- Dung dịch chuẩn: Pha loãng dung dịch gốc canxi 1000 g/ml với HCl 0,125N để được dung dịch có nồng độ canxi 100 g/ml. Trong 5 bình định mức 100 ml, thêm lần lượt vào mỗi bình 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0 ml dung dịch canxi 100 g/ml, thêm vào mỗi bình 1,0 ml dung dịch lanthan clorid, pha loãng với nước cho đủ thể tích. Các dung dịch chuẩn có nồng độ canxi lần lượt là 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0 g/ml.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39 6N và khoảng 1 ml dung dịch polysorbat 80, đun nóng trong cách thủy, thỉnh thoảng lắc cho đến khi dịch thuốc tan rã hoàn toàn, đun thêm 15 phút nữa, để nguội, pha loãng với nước cho đủ thể tích, lắc đều, lọc bỏ 10 ml dịch lọc, sử dụng dịch lọc (gọi là dung dịch gốc).
- Dung dịch thử: Hút chính xác 10,0 ml dung dịch gốc vào bình định mức 20 ml, pha loãng với HCl 0,125N cho đủ thể tích, lắc đều. Hút chính xác 1,0 ml dung dịch vào bình định mức 100 ml, thêm 1,0 ml dung dịch lanthan clorid, thêm HCl 0,125N cho đủ thể tích, lắc đều. Lúc này, dung dịch thu được có nồng độ canxi khoảng 2,1 g/ml. - Tiến hành đo phổ hấp thụ nguyên tử của các dung dịch chuẩn và dung dịch thử tại vạch phổ cực đại của canxi 422,7 nm. Sử dụng dung dịch HCl 0,125N có chứa 0,15% dung dịch lanthan clorid làm mẫu trắng.
Cách tính kết quả
- Hàm lượng canxi trong sản phẩm được tính theo công thức X = 0,001 x C x 1000 /M
- Trong đó:
C (g/ml): nồng độ canxi trong dung dịch thử được xác định dựa vào đường chuẩn.
M (mg): Lượng mẫu thí nghiệm
3.3.3.7. Xác định hàm lượng chất xơ theo phương pháp thủy phân Nguyên tắc
Phương pháp định lượng xenlulose dựa vào tính chất bền đối với tác dụng của axit mạnh và kiềm mạnh, không bị thủy phân dưới tác dụng của axit yếu, còn các chất khác thường đi kèm theo với xenlulose như hemixenlulose, lignin... ít bền hơn đối với tác dụng của axit và kiềm, nên bị oxy hóa, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu và dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp axit nitric với axit axetic.
Tiến hành: xem phụ lục 1e Tính toán kết quả
Hàm lượng xenlulose tính bằng công thức:
w a.100 =
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40 Trong đó:
X –hàm lượng xenlulose tính bằng (%); a – trọng lượng xenlulose (g);
w – trọng lượng mẫu thí nghiệm (g); 100 – hệ số chuyển thành (%).
3.3.3.8. Xác định hoạt độ chất ức chế trypsin theo tài liệu của Kakade và cộng sự (1974).
1. Nguyên liệu
- Đệm Tris (pH 8,2; nồng độ 0,05M) chứa CaCl2 nồng độ 0,02M.
Cách pha: Cân 6,05g Tris (tên khác hydroxymethylamino methane), 2,94g CaCl2.2H2O hoà tan vào khoảng 900ml nước. Chỉnh pH dung dịch đến 8,2 (bằng kiềm hoặc axit). Định mức thành 1 lít bằng nước.
- Dung dịch cơ chất (BAPA)
40 mg sofbenzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (BAPA) hydrochloride được hòa tan trong 1 ml dimethyl sulfoxide (DMSO) và pha loãng thành 100 ml với đệm Tris (phần 1) đã được làm ấm trước đến 37oC. Các dung dịch cơ chất BAPA được chuẩn bị hàng ngày khi sử dụng và cần được giữ ấm ở 37oC trong khi sử dụng (cả quá trình phân tích).
- Dung dịch trypsin
Hoà tan chính xác 4mg trypsin (dạng tinh thể, không có muối) trong 200ml dung dịch HCl 0,001 M. Dung dịch này có thể lưu trữ trong tủ lạnh trong 2 đến 3 tuần mà không mất hoạt tính đáng kể.
- Các mẫu đậu tương
Các dạng mẫu được nghiền mịn, đồng nhất kỹ
Chuẩn bị các mẫu đậu nành cho Khảo nghiệm /phân tích
Một gam mẫu hạt mịn (lọt qua sàng 100, phần đồng nhất mẫu) được chiết xuất với 50 ml NaOH 0,01 N. Thời gian chiết xuất cho mẫu đậu tươi nguyên liệu là khoảng 1 giờ trong khi cần thời gian dài hơn cho các mẫu đậu tương đã được sử lý nhiệt (rang, sấy…) Độ pH của dung dịch huyền phù thường là
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41 9,5-9,8 (nếu pH dưới 8.4. nên chiết xuất lại với dung dịch NaOH đậm đặc hơn để thu được dung dịch huyền phù có độ pH từ 8,4 đến 10,0). Dung dịch huyền phù nên được pha loãng đến nồng độ sao cho 1 ml sản xuất chất ức chế trypsin 40-60%. Giới hạn này là cần thiết để giảm độ lệch tiêu chuẩn tương đối.
- Mẫu trắng thuốc thử : 2 ml nước vào ống nghiệm, 2 ml dung dịch trypsin. Sau đó 1 ml dung dịch axit axetic 30%, thêm 5 ml dung dịch BAPA đã được duy trì ở nhiệt độ 37oC.
- Mẫu trắng từ mẫu: cho 5 ml dung dịch BAPA đã được duy trì ở nhiệt độ 370C vào ống nghiệm có chứa 2 ml mẫu đậu nành, ủ ở 37oC trong 10 phút, sau đó thêm 1 ml dung dịch axit axetic 30% và tiếp đó thêm 2 ml dung dịch trypsin.
2. Cách tiến hành
- Hút tương ứng bằng pipet (0; 0,6; 1,0; 1,4; và 1,8ml) dung dịch chiết (phần xử lý ở trên) vào các ống nghiệm, thêm nước để được tổng thể tích dung dịch là 2,0 ml.
- Thêm 2 ml dung dịch trypsin vào các ống nghiệm trêm, rồi đặt các ống nghiệm vào bể điều nhiệt (bếp cách thuỷ) ở 37 °C.
- Thêm vào mỗi ống nghiêm 5ml dung dịch BAPA đã được duy trì ở nhiệt độ 37oC;
- Sau 10 phút, thêm 1 ml dung dịch axit axetic 30%. Lắc đều dung dịch, lọc qua màng lọc và đo độ hấp thụ của dịch lọc tại bước sóng 410nm, hiệu chỉnh với mẫu trắng thuốc thử.
Nếu các dung dịch đậu nành không có sự hấp thụ đáng kể nào ở bước sóng 410 nm thì không cần thiết phải tiến hành xác định mẫu trắng từ mẫu. Nếu có độ hấp thụ, tiến hành chuẩn bị mẫu trắng từ mẫu.
Việc đọc khi hiệu chỉnh mẫu trắng với các dung dịch trung gian được xác định bằng cách tính toán học đơn giản: ví dụ, với mẫu trắng từ mẫu khi đọc độ hấp thụ khi đã hiệu chỉnh với mẫu trắng thuốc thử được độ hấp thụ là 0,1 nghĩa là độ hấp thụ cho 1ml dung dịch chiết sẽ là 0,05 độ hấp thụ .
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42 Một đơn vị trypsin (TU) được xác định khi tăng độ hấp thụ là 0,01 đơn vị tại 410 nm cho mỗi 10 ml của hỗn hợp phản ứng theo các điều kiện sử dụng (37oC trong 10 phút). Hoạt động chất ức chế trypsin được biểu diễn theo đơn vị TIU.
TIU = TU/10
3.3.3.9. Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí:Theo TCVN 4884:2005
Nguyên tắc: sử dụng kỹ thuật đổ đĩa, đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 30 ± 1oC trong thời gian từ 48 - 72h. Số lượng hiếu khí trong 1 g (hoặc 1 ml) mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng.
3.3.3.10. Xác định tổng số Coliforms: Theo TCVN 4882:2007
Nguyên tắc: Phát hiện và định lượng Coliforms bằng kỹ thuật nuôi cấy trong môi trường lỏng ủ ở 37oC, sử dụng cách tính số có xác xuất lớn nhất (MPN) để tính kết quả. Tổng số Coliform được xác định bằng số ống dương tính sau khi nuôi cấy vào các ống canh thang brilliantgreen broth 2% ở 37oC/ 24 – 48 giờ.
3.3.3.11. Xác định tổng số E. coli:Theo TCVN 6846:2007
Nguyên tắc: Phát hiện và định lượng E. coli bằng kỹ thuật nuôi cấy trong môi trường lỏng ủ ở 37oC, rồi ủ ở 44oC, sử dụng cách tính số có xác xuất lớn nhất (MPN) để tính kết quả.
3.3.3.12. Xác định B. cereus: Theo TCVN 4992:2005
Nguyên tắc: Cấy một lượng mẫu thử qui định nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác, lên bề mặt môi trường cấy đặc chọn lọc đựng trong đĩa petri. Ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30oC từ 18 – 48 giờ. Tính số lượng B. cereus trong 1 ml hoặc trong 1gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc khẳng định thu được trên các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn sao cho kết quả có ý nghĩa và được khẳng định theo phép thử qui định.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43
3.3.3.13. Xác định Cl. perfringens: Theo TCVN 4991:2005
Nguyên tắc: Các đĩa petri được cấy một lượng mẫu thử qui định, nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác. Ủ trong điều kiện kỵ khí các đĩa ở 37oC trong 20 giờ. Định lượng các khuẩn lạc điển hình.
3.3.3.14. Xác định tổng số bào tử nấm men, nấm mốc: Theo TCVN 5166:90
Nguyên tắc: Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa đếm khóm nấm trên môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 28±1o C trong thời gian từ 5- 7 ngày. Số lượng bào tử nấm men, nấm mốc trong 1g (ml) mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khóm nấm đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng.