M EU1 EU2 EU3 EU4 EU
4.4. Về sự đa dạng di truyền của loài Dấu dầu xoa nở Việt Nam
Kết quả khảo sát và thu mẫu cho thấy 5 mẫu Dấu dầu xoan phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam. Kích thước vùng ITS (725 - 731 bp) và tỉ lệ thành phần (G+C) (62,4 – 63,3%) của 5 mẫu Dấu dầu xoan tương đương với kích thước và tỉ lệ thành phần (G+C) của các mẫu Muồng truổng và Xít xa thu được trong phạm vi nghiên cứu của đề tài. Một nghiên cứu khác cho kết quả tỉ lệ thành phần (G+C) của 14 mẫu Tetradium ruticarpum (Rutaceae) thu hái từ các vùng khác nhau của Trung Quốc có kết quả tương đương dao động từ 62,4 – 64,1% [37].
73
Trong nghiên cứu này, 5 mẫu Dấu dầu xoan thu hái tại các vùng khác nhau ở Việt Nam (EU1-EU5) có mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN dao động từ 98,1- 99,7%, kết quả này thể hiện sự gần gũi tương đối về mặt di truyền của 5 mẫu. Sử dụng phép gióng hàng cho thấy sự khác biệt giữa các trình tự chủ yếu là các vị trí đa hình đơn, trong đó một nucleotid bị thay thế bởi một nucleotid khác (C được thay bằng G ở vị trí 69 trên mẫu EU2, EU4; C được thay bằng T ở vị trí 104 trên mẫu EU4, EU5, vị trí 282, 624 trên mẫu EU2, EU4; C được thay bằng A ở vị trí 138 trên mẫu EU2, EU4; G được thay bằng A ở vị trí 259, 612 trên mẫu EU2, EU4; G được thay bằng C ở vị trí 583 trên mẫu EU2, EU4; A được thay bằng T ở vị trí 604 trên mẫu EU2, EU4) . Ngoài ra, ở một số vị trí có sự thêm hoặc mất một nucleotid (mất C ở vị trí 111 trên mẫu EU5; thêm C ở vị trí 133 trên mẫu EU2, EU4, EU5, ở vị trí 588 trên mẫu EU1, EU5; thêm A ở vị trí 589, 590 trên mẫu EU1, EU5) dẫn đến sự khác biệt về kích thước đoạn ADN thu được. Tương tự như các mẫu Muồng truổng, đa số vị trí khác biệt xảy ra ở vùng ITS1 và ITS2. Như vậy, một lần nữa, kết quả nghiên cứu lại cho thấy sự khác biệt của các trình tự nucleotid vùng ITS-rADN chủ yếu tập trung tại vùng ITS1 và ITS2, 2 vùng được coi là siêu biến trong rADN theo các nhà nghiên cứu di truyền học [15, 18, 25]. Các kết quả này gợi ý hướng đi cho những nghiên cứu tiếp theo khi sử dụng rADN làm marker để đánh giá đa dạng di truyền hoặc phân loại thực vật ở mức độ dưới loài, chỉ nên so sánh trình tự ở 2 vùng ITS1/ITS2 thay vì cả vùng ITS như trước đây. Khi đó, vừa thuận lợi hơn cho nghiên cứu khi đoạn ADN cần giải trình tự ngắn hơn, mặt khác, kết quả so sánh sẽ cho khả năng phân loại rõ rệt hơn, hay theo ngôn ngữ của các nhà phân loại học là "độ phân giải" cao hơn. Trong thực tế, trình tự nucleotid của 1 trong 2 vùng ITS1 hoặc ITS2 đã được sử dụng làm marker phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền trong một số nghiên cứu. Theo nghiên cứu đã công bố của Shiin Chen và cộng sự, vùng ITS2 ở thực vật tương tự như CO1 ở động vật, là vùng có khả năng phân loại cao [18]. Vùng ITS2-rADN đã được sử dụng để phân biệt các loài trong chi
Heterodera (Heteroderidae) [30], để phân loại cây dược liệu thuộc họ Fabaceae [26]. Trong một nghiên cứu khác, Diane N. và cộng sự đã sử dụng vùng ITS1 để phân loại thành công 50 mẫu Boraginales [21].
74
Dựa trên 5 trình tự thu được, cây phân loại cho thấy trình tự vùng ITS-rADN của 5 mẫu Dấu dầu xoan chia thành 2 nhóm chính: nhóm 1 chỉ gồm trình tự vùng ITS-rADN của mẫu EU1, nhóm 2 gồm trình tự vùng ITS-rADN của 4 mẫu còn lại: EU2, EU3, EU4, EU5, được chia thành 3 nhóm nhỏ. Trong đóhệ số bootstrap của EU2 và EU4 là 100, EU2, EU4 và EU5 là 100, EU2, EU4, EU5 và EU3 là 81. Sự phân chia thành các nhóm (cluster) dựa trên sự tương đồng di truyền như trên sẽ tiếp tục là cơ sở để nghiên cứu tiếp tục xem có mối liên quan giữa sự khác biệt trình tự gen và sự khác biệt hàm lượng hoạt chất trong các mẫu thu hái này hay không.
Vùng ITS-rADN của 3 loài nghiên cứu có kích thước dao động từ 725 – 745bp, tỉ lệ %(G+C) dao động từ 61,3 – 64,75%. Khi tiến hành so sánh gióng hàng trình tự ITS-rADN: loài Dấu dầu xoan có 15 điểm khác biệt giữa 5 mẫu, loài Muồng truổng có 13 điểm khác biệt giữa 10 mẫu, loài Xít xa không có sự khác biệt giữa 3 mẫu. Tóm lại, các kết quả phân tích, so sánh trình tự ITS-rADN cho thấy có sự đa dạng tương đối thấp về trình tự nucleotid vùng ITS-rADN ở cả 3 loài. Mặc dù vậy, vẫn có thể phân nhóm dựa trên sự khác biệt về trình tự ITS-rADN đối với 2 loài Muồng truổng và Dấu dầu xoan. Để có thể khai thác và phát triển nguồn dược liệu từ Muồng truổng, Xít xa, Dấu dầu xoan ở Việt Nam một cách có hiệu quả hơn nữa, song song với đánh giá đa dạng di truyền cần tiến hành thực hiện những nghiên cứu đánh giá tác dụng sinh học, và đặc biệt là so sánh hàm lượng berberin của các mẫu đã thu được. Trên cơ sở đó khi kết hợp với các kết quả về đa dạng gen vùng ITS chúng ta có thể chọn tạo được giống có năng suất cao và chất lượng tốt nhằm phát triển và tiêu chuẩn hóa nguồn dược liệu Muồng truổng, Xít xa, Dấu dầu xoan. Mặt khác, cần có những nghiên cứu đa dạng di truyền của 3 loài trên với các chỉ thị phân tử khác nhằm tìm ra những chỉ thị có hiệu quả đánh giá đa dạng di truyền tốt hơn ở bậc phân loại dưới loài.
75
KẾT LUẬN
1. Đã xác định được trình tự nucleotid vùng phiên mã nội thuộc ADN ribosom của 10 mẫu Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.), 03 mẫu Xít xa (Toddalia asiatica L.) và 05 mẫu Dấu dầu xoan (Tetradium glabrifolium) thu hái tại các vùng khác nhau ở Việt Nam.
2. Đã so sánh được trình tự nucleotid vùng ITS-rADN:
- Mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 10 mẫu Muồng truổng thu hái tại các vùng khác nhau ở Việt Nam dao động từ 99,0-99,9%.
- Mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 3 mẫu Xít xa thu hái tại các vùng khác nhau ở Việt Nam là 100%.
- Mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu Dấu dầu xoan thu hái tại các vùng khác nhau ở Việt Nam dao động từ 98,1- 99,7%.
KIẾN NGHỊ
Trên cơ sở các nhóm phân loại về trình tự ADN, tiếp tục triển khai nghiên cứu tác dụng sinh học kết hợp nghiên cứu hóa học nhằm chọn tạo giống Muồng truổng, Xít xa và Dấu dầu xoan cho năng suất cao, chất lượng tốt để phát triển hơn nữa những ứng dụng nguồn thảo dược Việt Nam.