TOP10F’
Nguyên tắc: Tế bào vi khuẩn được hoạt hóa nhờ nuôi cấy trong môi trường đến đầu pha log. Khi nhiệt độ thay đổi đột ngột, làm tính thấm màng tế bào thay đổi cho phép tế bào nhận ADN ngoại lai. Sau đó, cấu trúc màng tế bào hồi phục lại và giữ ADN ngoại lai trong tế bào. Các tế bào mang ADN tái tổ hợp được phát hiện trên môi trường chọn lọc có kháng sinh thích hợp và chất chỉ thị màu X- gal.
Ở thí nghiệm này chúng tôi sử dụng phương pháp sốc nhiệt với sự có mặt của CaCl2.
Quá trình này bao gồm hai giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp.
a) Tạo tế bào khả biến
- Lấy chủng tế bào được cất giữ ở -750C.
- Cấy vạch tế bào trên đĩa môi trường LB đặc, ủ đĩa cấy qua đêm ở 370C để thu lấy khuẩn lạc riêng rẽ. Tách một khuẩn lạc nuôi cấy trong 2mL môi trường LB lỏng.
- Cấy chuyển 2% dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang 2mL môi trường LB lỏng. Nuôi lắc ở 370C, 200 vòng/phút trong 90 phút.
- Kiểm tra mật độ tế bào sao cho OD600 đạt 0,6-1,0.
- Chuyển dịch tế bào sang ống eppendorf vô trùng, để trên đá 10 phút. - Ly tâm thu sinh khối (5000 vòng/phút, 40C trong 10 phút).
- Loại dịch nổi, đặt ống chứa tế bào trên đá 10 phút. - Hòa cặn tế bào trong 1mL CaCl2 100mM.
- Đặt lại ống tế bào trên đá 30 phút.
- Ly tâm thu tế bào 3000 vòng/phút trong 10 phút. - Hòa lại tế bào trong 60µL CaCl2 100mM.
- Để ống tế bào trên đá trước khi sử dụng khoảng 2-3 giờ.
- Nếu muốn bảo quản lâu ngày, bổ sung glycerol đến nồng độ 30%. - Bảo quản ở -750C [48].
29
b) Biến nạp
Biến nạp là quá trình chuyển ADN trực tiếp vào tế bào thể nhận. Cơ chế biến nạp bao gồm việc làm thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để ADN plasmid dễ dàng chui vào tế bào thể nhận. Quá trình biến nạp ADN plasmid vào tế bào E.coli
chủng TOP10F’như sau: