M EU1 EU2 EU3 EU4 EU
3.3.3.Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN của các mẫu Dấu dầu xoan
Sau khi tiến hành phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1%, tiến hành chọn dòng đoạn gen nhằm mục đích tạo dòng plasmid mang gen ITS-rADN để phục vụ cho giải trình tự. Các tế bào E.coli sau khi biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin, X-gal và IPTG, sau đó nuôi trong tủ ấm 370C qua đêm thu được các khuẩn lạc có màu xanh và trắng. Chọn 1 khuẩn lạc xanh và 15 khuẩn lạc trắng để tách plasmid và điện di kiểm tra plasmid trên gel agarose. Kết quả thể hiện ở hình 3.15
750 bp
59
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Hình 3.15. Ảnh điện di plasmid tách từ các khuẩn lạc của 5 mẫu Dấu dầu xoan
Ghi chú: 1,2,3: plasmid tách từ khuẩn lạc trắng của mẫu EU1; 4,5,6: plasmid tách từ khuẩn lạc trắng của mẫu EU2; 7,8,9: plasmid tách từ khuẩn lạc trắng của mẫu EU3; 10: plasmid tách từ khuẩn lạc xanh; 11,12,13: plasmid tách từ khuẩn lạc trắng của EU4; 14,15,16: plasmid tách từ khuẩn lạc trắng của EU5
Nhận xét:
Plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng có kích thước lớn hơn so với plasmid tách từ khuẩn lạc xanh tương ứng trên bản gel (đường chạy 10). Do đó nhiều khả năng các dòng E.coli này mang vector tái tổ hợp chứa đoạn gen ITS-rADN. Tuy nhiên, để khẳng định chính xác điều này, ở mỗi mẫu chúng tôi tiến hành chọn ra 1 plasmid từ khuẩn lạc trắng để cắt bằng enzym giới hạn EcoRI.
Hình 3.16 thể hiện sản phẩm cắt kiểm tra plasmid từ khuẩn lạc ở các đường chạy số 1, 4, 7, 11 và 14.
60
1 4 7 11 14
Hình 3.16. Sản phẩm cắt plasmid bằng enzym giới hạn EcoRI của 5 mẫu
Dấu dầu xoan
Ghi chú: 1, 4, 7, 11, 14 lần lượt là đường chạy của sản phẩm cắt plasmid từ khuẩn lạc các mẫu EU1, EU2, EU3, EU4, EU5 .
Nhận xét:
Sau khi cắt bằng enzym giới hạn EcoRI, 5 plasmid tái tổ hợp tách ra một đoạn ADN có kích thước gần 750bp, tức là tương đương kích thước của sản phẩm PCR ban đầu. Từ đó có thể khẳng định đã biến nạp thành công plasmid mang gen ITS-rADN vào dòng tế bào E.coli tương ứng. Dòng tế bào E.coli này được nuôi cấy nhằm cung cấp nguồn gen ITS-rADN chuẩn bị cho phản ứng xác định trình tự ADN