Mồi dùng cho phản ứng PCR: cặp mồi ITS4 và ITS5 cung cấp bởi Bioneer. Trình tự nucleotid của cặp mồi được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Cặp mồi dùng trong phản ứng PCR
Tên mồi Trình tự nucleotid
ITS4 (R) 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
ITS5 (F) 5’-GAAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’
Thang ADN chuẩn 1 Kb, enzym Taq ADN polymerase, dung dịch đệm cho Taq polymerase, dNTP, ethidium bromid, ethanol, Tris-base, acid acetic, EDTA, glycerol, agarose (BioNeer, Hàn Quốc), xanh bromophenol, agar, ampicillin, X-gal, MgCl2, TAE, cồn 96% và một số hóa chất khác dùng trong sinh học phân tử của các hãng BioLab, BioRad, Merck, Fermentas.
Dung dịch tách plasmid:
- Sol I: Tris HCL, pH 8:25mM, EDTA, pH 8: 10mM, glucose:50mM. - Sol II: NaOH:0,2M, SDS: 1%.
- Sol III: đệm acetat kali 3M, pH 5,5.
- Dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1).
- Dung dịch TE (10mM Tris-HCl pH 8,0; 1mM EDTA). Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (LB, g/L):
- LB lỏng (g/L): Cao nấm men:5g, trypton:10g, NaCl:5g, pH 7,4 (chỉnh bằng NaOH 5N).
23
- LB đặc (g/L): Cao nấm men:5g, trypton:10g, NaCl:5g, agar:15g. Hóa chất dùng cho điện di ADN:
- Dung dịch đệm điện di TAE 1X: lấy từ dung dịch gốc TAE 50X có thành phần như sau: Tris base:121g, acid acetic băng: 28,6mL, 0,5M EDTA pH 8,0: 50mL, nước khử ion vừa đủ: 500mL.
- Gel Agarose 1%: 1 gam agarose, bổ sung 100mL đệm TAE 1X, làm tan agarose trong lò vi sóng khoảng 2-3 phút. Để nhiệt độ hạ xuống khoảng 500C rồi đổ ra khay điện di đã có lược tạo giếng tra mẫu.
- Ethidium bromid (EtBr) dung dịch mẹ: 10mg/mL. Hòa 1 gam EtBr vào 100mL H20. Khuấy từ từ cho tan đều. Giữ trong lọ màu ở nhiệt độ phòng. Khi dùng pha 20µL dung dịch mẹ trong 100mL đệm TAE 1X.
- Đệm tra mẫu ADN 5X: Tris-HCl 1M pH 8,0 : 1mL EDTA 0,5 M pH 8,0: 0,2mL, glycerol: 2mL, xanh bromophenol 1%: 2mL.
Bộ kit chiết tách ADN thực vật Plant Tissue (Solution Type) của hãng Solgen Co.Ltd.
Để tách dòng gen, sử dụng bộ kit TA cloning kit (Invitrogen). Trong bộ kit này gồm các thành phần : vector PCR 2.1 (đã mở vòng có đầu dính T), enzym T4- ligase, đệm ligase 10X, tế bào E.coli chủng TOP10F’.
Bộ kit tinh sạch vector tái tổ hợp phục vụ cho mục đích giải trình tự gen (Fermentas).