M ZA1 ZA2 ZA3 ZA4 ZA5 ZA6 ZA7 ZA8 ZA9 ZA
3.1.3.Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN của các mẫu Muồng truổng
Sau khi tiến hành phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1%, tiến hành chọn dòng đoạn gen nhằm mục đích tạo dòng plasmid mang gen ITS-rADN để phục vụ cho giải trình tự. Các tế bào E.coli sau khi biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin, X-gal và IPTG, sau đó nuôi trong tủ ấm 370C qua đêm thu được các khuẩn lạc có màu xanh và trắng. Chọn 2 khuẩn lạc xanh và 20 khuẩn lạc trắng để tách plasmid và điện di kiểm tra plasmid trên gel agarose. Kết quả thể hiện ở hình 3.3
750 bp
36
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Hình 3.3. Ảnh điện di plasmid tách từ các khuẩn lạc của 10 mẫu Muồng truổng
Ghi chú: 1,2: plasmid tách từ khuẩn lạc trắng của mẫu ZA1; 3,4: plasmid tách từ khuẩn lạc trắng của mẫu ZA2; 5,6: plasmid tách từ khuẩn lạc trắng của mẫu ZA3; 7,8: plasmid tách từ khuẩn lạc trắng của ZA4; 9,10: plasmid tách từ khuẩn lạc trắng của ZA5; 11: plasmid tách từ khuẩn lạc xanh; 12, 13: plasmid tách từ khuẩn lạc trắng của mẫu ZA6; 14,15: Plasmid tách từ khuẩn lạc trắng của mẫu ZA7; 16: plasmid tách từ khuẩn lạc xanh; 17,18: Plasmid tách từ khuẩn lạc trắng của mẫu ZA8;19, 20: Plasmid tách từ khuẩn lạc trắng của mẫu ZA9; 21,22: Plasmid tách từ khuẩn lạc trắng của mẫu ZA10.
Nhận xét:
Plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng (trừ đường chạy số 6) có kích thước lớn hơn so với plasmid tách từ khuẩn lạc xanh tương ứng trên bản gel (đường chạy 11, 16). Do đó nhiều khả năng các dòng E.coli này mang vector tái tổ hợp chứa đoạn gen ITS-rADN. Tuy nhiên, để khẳng định chính xác điều này, ở mỗi mẫu chúng tôi tiến hành chọn ra 1 plasmid từ khuẩn lạc trắng để cắt bằng enzym giới hạn EcoRI.
Hình 3.4 thể hiện sản phẩm cắt kiểm tra plasmid từ khuẩn lạc ở các đường chạy số 1, 3, 5, 7, 9, 13, 15, 17, 19 và 21.
37
M ZA1 ZA2 ZA3 ZA4 ZA5 ZA6 ZA7 ZA8 ZA9 ZA10
Hình 3.4. Sản phẩm cắt plasmid bằng enzym giới hạn EcoRI của 10 mẫu
Muồng truổng
Ghi chú: M – Đường chạy của ADN marker.
ZA1-ZA10 lần lượt là đường chạy của sản phẩm cắt plasmid tương ứng với mẫu ZA1-ZA10.
Nhận xét:
Sau khi cắt bằng enzym giới hạn EcoRI, các plasmid tái tổ hợp tách ra một đoạn ADN có kích thước gần 750 bp, tức là tương đương kích thước của sản phẩm PCR ban đầu. Từ đó có thể khẳng định đã biến nạp thành công plasmid mang gen ITS-rADN vào dòng tế bào E.coli tương ứng. Dòng tế bào E.coli này được nuôi cấy nhằm cung cấp nguồn gen ITS-rADN chuẩn bị cho phản ứng xác định trình tự ADN.