2.3.1. Nguyên liệu nghiên cứu
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 30 - Môi trường nước thịt dùng để ni cấy mẫu xét nghiệm từ ựầu.
- Môi trường thạch thường ựể kiểm tra khuẩn lạc và làm kháng sinh ựồ.
2.3.1.2. Các môi trường chuyên dụng dùng trong phân lập và giám ựịnh vi khuẩn
Các môi trường chuyên dụng dùng ựể phân lập các loại vi khuẩn có mặt chủ yếu ở tử cung lợn nái khi bị viêm.
- Môi trường thạch máu dùng ựể giữ và bảo quản vi khuẩn.
- Môi trường Sapman dùng ựể phân lập và xác ựịnh ựộc lực Staphylococcus.
- Môi trường Brilliant Green agar dùng ựể phân lập vi khuẩn E. coli và salmonella.
- Môi trường Edwards medium dùng ựể phân lập vi khuẩn Streptococcus.
2.3.1.3. Giấy tẩm kháng sinh
Các mảnh giấy ựã ựược tẩm kháng sinh theo ựúng tiêu chuẩn Quốc tế. Các
thuốc kháng sinh dùng ựể tẩm ựều ựạt tiêu chuẩn dược ựiển Việt Nam 1994 do phòng quản lý thuốc thú y - Cục thú y cấp. Với mỗi loại giấy tẩm kháng sinh lại có mức ựộ mẫn cảm và hàm lượng kháng sinh trong từng mảnh giấy khác nhau trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Kháng sinh chuẩn với tắnh mẫn cảm của vi khuẩn
Tên thuốc Kháng sinh trong một mảnh giấy (mg) Kháng thuốc φ φ φ φ (mm) Mẫn cảm trung bình φ φ φ φ (mm) Rất mẫn cảm φ φφ φ (mm) Doxycycline 30 ≤17 17-22 ≥23 Tetracyllin 30 ≤14 15-18 ≥19 Amoxycillin 25 ≤18 18-20 ≥21 Erythromycin 15 ≤13 13-17 ≥18 Cloxacillin 1 ≤15 15-17 ≥18 Gentamicin 10 ≤15 15-16 ≥17 Norfloxacin 10 ≤12 13-17 ≥18 Penicillin 10UI ≤20 21-28 ≥29 Ampicillin 10 ≤11 12-13 ≥14 Neomycin 30 ≤15 15-17 ≥18
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2.1. Phương pháp hồi cứu
- Xác ựịnh tỷ lệ lợn nái mắc bệnh viêm tử cung bằng phương pháp ựiều tra,
sử dụng số liệu qua hồ sơ, phỏng vấn trực tiếp công nhân, chủ các trang trại chăn nuôi lợn nái ngoại.
- Kết hợp với theo dõi và quan sát trực tiếp các biểu hiện lâm sàng trên ựàn lợn nái mắc bệnh viêm tử cung.
2.3.2.2. Phương pháp lấy mẫu dịch tử cung của lợn bình thường sau ựẻ và lợn ựang bị viêm tử cung
- Lấy mẫu dịch tử cung của lợn nái bình thường sau ựẻ 12-24h và lợn bị viêm tử cung. Phân lập, giám ựịnh thành phần vi khuẩn trên các môi trường chuyên dụng theo các phương pháp vi sinh vật thường quy.
- Làm kháng sinh ựồ theo phương pháp của Kirby-Bauer (1996). - Giấy tẩm kháng sinh do hãng Oxoid (Anh) sản xuất.
- đánh giá kết quả dựa theo tiêu chuẩn quốc tế 1996.
* Cách lấy mẫu dịch tử cung lợn xét nghiệm
Dùng mỏ vịt (ựã ựược sát trùng) ựể mở âm ựạo, sau đó dùng dẫn tinh quản
ựưa qua cổ tử cung ựể lấy dịch viêm từ tử cung rồi cho vào ống nghiệm ựã được vơ trùng, mỗi lần lấy khoảng 3 - 5 ml.
* Bảo quản và xử lý mẫu
- Các mẫu thắ nghiệm sau khi lấy ựược giữ trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ 2-80C
trong vòng 24h chuyển ựến phịng thắ nghiệm và tiến hành kiểm tra theo
phương pháp nghiên cứu vi khuẩn học.
2.3.2.3. Phương pháp xác ựịnh số loại vi khuẩn
Chúng tôi dùng phương pháp xét nghiệm theo phương pháp thường quy trong phòng thắ nghiệm ựể phân loại vi khuẩn.
- Các ựĩa thạch thường sau khi ựã ria cấy vi khuẩn, bồi dưỡng trong tủ ấm
37oC/24h, lấy ra quan sát hình thái, kắch thước và dạng khuẩn lạc. Từ đó sơ bộ ựịnh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 32 - Mỗi loại vi khuẩn, khi mọc trên mơi trường có thể sẽ hình thành một loại khuẩn lạc có kắch thước, hình dáng và màu sắc riêng biệt như:
+ Staphylococcus: Khuẩn lạc dạng S, rìa gọn, trịn, mặt lồi, láng bóng và có màu vàng rơm (nếu là Staphylococcus aureus).
+ Streptococcus: Khuẩn lạc dạng S, nhỏ, màu hơi xám bóng.
+ Salmonella: Khuẩn lạc dạng S, có thể khuẩn lạc dạng R, khuẩn lạc trịn
trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa.
+ E. coli: Khuẩn lạc dạng S, có thể khuẩn lạc dạng R, khuẩn lạc trịn ướt, khơng trong suốt, màu tro, trắng nhạt hai ựầu.
Sau khi xác ựịnh ựược các loại khuẩn lạc khác nhau, mỗi loại khuẩn lạc lại
tiến hành phiết kắnh, nhuộm Gram để xem hình thái, tắnh chất bắt màu và cấu trúc ựặc biệt của vi khuẩn.
+ Staphylococcus bắt màu Gram (+), hình cầu, tụ lại hình chùm nho.
+ Streptococcus bắt màu Gram (+), có hình cầu hoặc hình trứng, ựứng riêng
lẻ hoặc thành chuỗi.
+ E. coli bắt màu Gram (-), là trực khuẩn hình gậy ngắn 2 ựầu trịn.
+ Salmonella bắt màu Gram (-), trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu trịn.
Khuẩn lạc ựã ựược tách thuần khiết, cấy vào các môi trường phân lập ựể xác ựịnh tắnh chất mọc của chúng trong các môi trường này.
+ Mơi trường Sapman: Staphylococcus khuẩn lạc to, rìa gọn. Nếu là tụ cầu
gây bệnh thì mơi trường biến thành màu vàng, tụ cầu không gây bệnh thì mơi trường giữ nguyên màu ựỏ.
+ Môi trường Edwards medium: Streptococcus khuẩn lạc nhỏ, mặt hơi lồi,
ướt mịn, rìa gọn.
+ Mơi trường Brilliant green agar: E. coli làm môi trường biến màu vàng
chanh. Salmonella làm mơi trường có màu ựỏ.
- Cuối cùng cấy chuyển thạch máu giữ giống ựể giám ựịnh tiếp nếu có
Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
2.3.2.4. Xác ựịnh ựộ mẫn cảm của các chủng vi khuẩn phân lập ựược từ dịch viêm tử cung lợn với các thuốc hóa học trị liệu bằng phương pháp làm kháng sinh ựồ
- Chúng tôi tiến hành làm kháng sinh ựồ theo phương pháp khuếch tán trên thạch của Kirby-Bauer (1996).
- Phương pháp chỉ dùng canh trùng nuôi cấy vi khuẩn ở 370C trong 24 giờ,
ria cấy trên mặt thạch. để ựĩa thạch từ 3-5 phút. Sau ựó dùng panh vơ trùng ựặt các
mảnh giấy tẩm kháng sinh tiếp xúc với mặt thạch. Các mảnh giấy kháng sinh ựặt
cách nhau không dưới 24mm.
- Sau khi ựặt các mảnh giấy vào ựĩa thạch ựược khoảng 15 phút, ựặt ựĩa thạch
vào tủ ấm 370C, sau 16-18 giờ lấy ra ựọc kết quả. Kết quả ựược ựọc bằng cách dùng
thước mm ựể ựo đường kắnh của vòng vô khuẩn, ựo phắa sau mặt ựĩa thạch. Nếu cạnh của vịng ức chế khơng rõ nét thì phải ựo chỗ hẹp nhất và chỗ rộng nhất rồi lấy giá trị
trung bình. đường kắnh của vịng vơ khuẩn ựược tắnh ra mm. Nếu khuẩn lạc trong
vòng ức chế rõ ràng thì phải ni cấy, phân lập và thử lại.
- Kết quả kháng sinh ựồ chỉ ựược ứng dụng ựiều trị với vi khuẩn mẫn cảm
với thuốc kháng sinh, còn khi vi khuẩn ựã kháng thuốc thì khơng ựược dùng.
2.3.2.5. Phương pháp xác ựịnh các ựại lượng
+ Tỷ lệ lợn mắc bệnh (%) = + Tỷ lệ ựộng dục lại (%) =
+ Tỷ lệ thụ thai (%) =