Trên thế giới, nền kinh tế của các nước đang ngày càng phát triển, đời sống vật chất được nâng cao, vấn đề sức khỏe con người ngày càng được quan tâm. Ngộ độc thực phẩm đang là mối đe dọa đối với người tiêu dùng trên toàn thế giới. Có hơn 200 bệnh lây truyền qua thực phẩm. Những tác nhân gây bệnh gồm: Virus, vi trùng, ký sinh trùng, độc tố,…
Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), hàng năm trên thế giới có khoảng 1.400 triệu trẻ em bị tiêu chảy, trong đó có khoảng 70% các trường hợp bị bệnh là do nhiễm khuẩn qua đường ăn uống. Wall và cs (1998) [42] cho biết trong thời gian từ năm 1992 đến năm 1996, tại Anh và sứ Wales đã xảy ra
2.877 vụ ngộ độc mà nguyên nhân là do vi sinh vật làm cho 26.722 người bị bệnh, trong đó 9.160 người phải nằm viện và 52 người tử vong.
Theo thống kê của Trung tâm nghiên cứu và Hoạch định chính sách về bệnh truyền nhiễm (CIDRAP) thuộc Viện Đại học tiểu bang Minnesota - Mỹ, năm 2007, cả nước Mỹ có 17.883 ca ngộ độc thực phẩm, trong số đó có 38% bệnh nhân nhiễm Salmonella. Hàng năm, ở Mỹ có khoảng 40.000 trường hợp bị nhiễm Salmonella nhưng thực tế chỉ có khoảng 1 - 5% là được thống kê và có khoảng 400 trường hợp tử vong do Salmonella, làm thiệt hại tới hơn 50 triệu USD nên vi khuẩn này được liệt vào loại gây ngộ độc thực phẩm nguy hiểm nhất tại Mỹ. Trong số ca nhiễm khuẩn Salmonella, phần lớn bệnh nhân bị nhiễm S. enteritidis (24,7%) và S. typhimurium (23,5%).
Cơ quan An toàn thực phẩm châu Âu và Trung tâm phòng chống, kiểm soát dịch bệnh châu Âu, năm 2009 cho biết khu vực EU có tổng cộng 108.614 trường hợp nhiễm Salmonella trên người được xác định, giảm 17,4% so với năm 2008. Trong đó, các quốc gia Đức, Ba Lan, Cộng hòa Séc, Anh và Bồ Đào Nha chiếm hơn một nửa các trường hợp được xác nhận (56%). Cụ thể: năm 2009, nước Đức có 31.395 trường hợp nhiễm Salmonella trên người, ở Cộng hòa Séc là 10.480 trường hợp, ở Ba Lan là 8.521 trường hợp.
Năm 1880, Eberth lần đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi. Bốn năm sau (1984), Gaffky đã nuôi cấy thành công vi khuẩn này. Năm 1891, Jensen đã phân lập được S. dublin từ bệnh phẩm của bê bị tiêu chảy. Cũng vào năm đó, S. typhimurium được phát hiện ở vùng Greiswald và Breslau. Hai năm sau đó (1893), tại Breslau đã xảy ra một vụ ngộ độc thịt do ăn phải thịt bò ốm, kết quả là bệnh đã xảy ra ở người. Kaensche là người tìm thấy vi khuẩn, vì vậy vi khuẩn được đặt tên là trực khuẩn Kaensche (Selbizt, 1995) [41].
Tất cả các bệnh do Salmonella gây ra lúc đầu được đặt tên chung là Phó thương hàn “Para - typhus”, cho đến năm 1914, có 12 loài vi khuẩn được mô tả và xếp vào giống Salmonella.
Năm 1926, với những công trình nghiên cứu của White về cấu trúc kháng nguyên của Salmonella đã bắt đầu một thời kỳ khoa học mới về giống vi khuẩn này. Sau đó Kauffman cũng rất thành công trong lĩnh vực nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella. Năm 1934, Kauffman và White đã thiết lập được bảng cấu trúc kháng nguyên đầu tiên và đặt tên là bảng phân loại Kauffman - White. Từ đó đến nay, bảng cấu trúc kháng nguyên của Salmonella luôn luôn được bổ sung. Năm 1993, đã có 2.375 serovar Salmonella đã được định danh (Selbizt, 1995) [41]. Năm 1997, số serovar đã lên đến 3.000 (Plonait và Bickhardt, 1997) [39]. Như vậy, giống Salmonella luôn luôn thu hút sự chú ý của các nhà chuyên môn trong lĩnh vực vi sinh vật.
Tại Nhật Bản, Asai và cs (2002) [29] cho biết tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn sau cai sữa bị tiêu chảy là 12,4%; lợn vỗ béo là 17,3%; lợn con theo mẹ là 4,5%. Tác giả cũng cho biết S. typhimurium được phân lập thấy nhiều nhất ở lợn sau cai sữa là 72,6%; lợn gần xuất chuồng là 73,8%.
Kishima và cs (2008) [35] đã điều tra tỷ lệ nhiễm và phân bố của vi khuẩn
Salmonella trong phân lợn khỏe mạnh bình thường trên toàn lãnh thổ Nhật Bản giữa năm 2003 và năm 2005 là 3,1%. Hiện nay, có rất nhiều loại thuốc kháng sinh có thể được sử dụng để điều trị bệnh, nhất là với lợn con trước và sau cai sữa. Tuy nhiên, do việc sử dụng rộng rãi thuốc kháng sinh để phòng và điều trị bệnh nên đã xuất hiện các chủng vi khuẩn Salmonella kháng thuốc.
Như vậy, vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra được rất nhiều các nhà vi sinh vật trên toàn thế giới quan tâm. Mục đích của các nghiên cứu này nhằm tìm ra các biện pháp có hiệu quả để đóng góp phần ngăn chặn và đẩy lùi bệnh do Salmonella gây ra ở động vật và ở người.
Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng, nguyên liệu và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Thịt lợn tươi, sống bán ở một số chợ của tỉnh Bắc Giang. - Vi khuẩn Salmonella spp.
3.1.2. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
3.1.2.1. Mẫu xét nghiệm
- Thịt lợn tươi, sống.
3.1.2.2. Các loại môi trường sử dụng cho quá trình nghiên cứu
- Môi trường thông thường và đặc hiệu để nuôi cấy, phân lập và giám định tổng số vi khuẩn Salmonella spp là những môi trường chế biến sẵn ở dạng tổng hợp:
+ Môi trường tăng sinh Nutrient Bronth: Dùng để nuôi cấy vi khuẩn
Salmonella.
+ Môi trường Selenite Broth: Dùng để nuôi dưỡng vi khuẩn Salmonella. + Môi trường XLD (Xylose Lysine Deoxycholate ): Dùng để phân lập vi khuẩn Salmonella.
+ Môi trường thạch nghiêng TSI (Triple Sugar Iron Agar): Dùng để kiểm tra khả năng lên men đường glucoza, lactoza, saccaroza, sinh hơi, sinh H2S,…
+ Môi trường BHI (Brain Heart Infusion Broth): Dùng để định type và giữ giống vi khuẩn.
+ Môi trường thạch máu (Blood Agar): Dùng để phân lập và thử khả năng dung huyết của vi khuẩn.
- Hóa chất dùng để nhuộm gram:
Dung dịch thuốc nhuộm: Tím Gentian, đỏ Fuchsin, cồn, đung dịch Lugol, nước cất.
- Khoanh giấy thử kháng sinh đồ và một số hóa chất dùng trong phòng thí nghiệm khác.
3.1.2.3. Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng khỏe mạnh, có trọng lượng 18 - 20g/con, đủ tiêu chuẩn phù hợp với nội dung nghiên cứu.
3.1.2.4. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Đĩa petri, pipetman, cân điện tử, túi đựng mẫu, nồi hấp cách thủy, tủ sấy khô với biên độ nhiệt 250oC, bình thuỷ tinh dung tích 250 - 1000ml, bình tam giác các loại, ống nghiệm, cốc đong, ống đong, đèn cồn, que cấy, cối chày sứ, dao, kéo, buồng cấy vô trùng, tủ lạnh, kính hiển vi, tủ ấm…
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.2.1. Địa điểm
- Địa điểm lấy mẫu: Chợ Cầu Gồ, Nhã Nam, Cao Thượng của tỉnh Bắc Giang.
- Địa điểm phân tích mẫu: Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên.
3.2.2. Thời gian
- Từ ngày 03/06 - 18/11/2013
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp trên thịt lợn tươi.
- Xác định các đặc tính sinh hóa của các chủng Salmonella đã phân lập được.
- Thử độc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được trên chuột bạch khỏe.
- Xác định tính mẫn cảm của các chủng Salmonella đã phân lập được đối với một số loại kháng sinh hóa dược.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
Để thực hiện đề tài này, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu thường quy định trong phòng thí nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn Quốc tế (ISO).
3.4.1. Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm
- Dụng cụ lấy mẫu, vật chứa mẫu phải sạch, vô trùng và không gây ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật của mẫu thịt.
- Lấy mẫu thịt: Khử trùng dao bằng cồn 70o
C, sau đó dùng dao cắt lấy 100 - 200 gram thịt/mẫu rồi cho mẫu vào túi nilon vô trùng và ghi nhãn có các thông tin cần thiết. Các mẫu thịt lợn sau khi lấy phải bảo đảm không lẫn nhau. Sau khi mang về phòng thí nghiệm nếu không phân tích ngay thì phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 0o
C - 2oC và phải kiểm tra trong vòng 24 giờ.
3.4.2. Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn Salmonella trong thịt lợn tươi. thịt lợn tươi.
Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella trong thịt lợn tươi áp dụng theo TCVN 5153:1990 [14].
Bước 1: Chuẩn bị, đồng nhất mẫu và tăng sinh lần 1:
Lấy thịt lợn ngẫu nhiên ở nhiều vị trí khác nhau của mẫu, cho vào cối sứ vô trùng nghiền nhuyễn. Cân chính xác trong điều kiện vô trùng 25g mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml môi trường dinh dưỡng Nutrient Broth, lắc đều trong thời gian nhất định ta được dung dịch mẫu với độ pha loãng 10-1. Để tủ ấm 37oC trong 16 - 24 giờ.
Bước 2: Tăng sinh lần 2 mẫu đã đồng nhất (tăng sinh chọn lọc)
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, sau đó dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu đã đồng nhất và tăng sinh theo bước 1 cấy vào 9ml môi trường Selenite Broth, nuôi tủ ấm 37oC trong 24 giờ (ở nhiệt độ này Proteus spp và nhiều vi khuẩn tạp nhiễm từ phân bị ức chế không phát triển).
Bước 3: Phân lập và nhận diện
Dùng que cấy thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa thạch XLD - một loại môi trường phân lập đặc trưng cho vi khuẩn Salmonella. Sau đó nuôi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ rồi đọc kết quả.
Salmonella phát triển mạnh, không lên men lactose, khuẩn lạc dạng S, màu đỏ, giữa có chấm đen, tròn (do sản sinh H2S).
3.4.3. Phương pháp nhuộm Gram xác định hình thái vi khuẩn
Sau khi nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu, chúng tôi tiến hành nhuộm Gram nhằm xác định đặc điểm hình thái và khả năng bắt màu của vi khuẩn.
Dùng bút sáp để ghi tên mẫu hoặc số nhận diện, ngày thử nghiệm lên phiến kính chuẩn bị phết vi khuẩn.
Dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng nước cất vô trùng đặt vào giữa phiến kính. Lấy một lượng nhỏ vi khuẩn từ khuẩn lạc và dàn mỏng với nước cất trên phiến kính. Để dịch khuẩn khô tự nhiên, sau đó hơ mặt dưới của phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 đến 3 lần (tránh không để tiêu bản quá nóng).
+ Nhỏ một giọt dung dịch Gentian lên lam kính để lưu lại trong thời gian 1 phút, sau đó rửa bằng nước cất.
+ Cố định màu vi khuẩn bằng cách phủ dung dịch Lugol lên lam kính trong thời gian 1 phút rồi rửa lại bằng nước cất.
+ Tẩy màu nhanh bằng cồn Axeton trong vòng 15 - 20 giây, sau đó rửa lại bằng nước cất.
+ Nhỏ 1 giọt dung dịch Fushin lên lam kính sau thời gian 2 phút. Sau rửa lại bằng nước cất.
Dùng giấy thấm để thấm khô hoặc để khô tự nhiên. Nhỏ một giọt dầu bạch dương lên phiến kính quan sát hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi với vật kính dầu (100).
3.4.4. Phương pháp xác định serovar của vi khuẩn Salmonella spp phân lập được
- Sử dụng kháng huyết thanh đơn giá.
- Nguyên lý: Đối với kháng nguyên hữu hình, khi gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng thì các vi khuẩn sẽ kết lại với nhau thành đám lớn mà mắt thường ta có thể quan sát được. Đây là phản ứng ngưng kết, sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể nhanh và xảy ra trên phiến kính.
- Chuẩn bị: Khuẩn lạc vi khuẩn được nuôi cấy vào ống thạch dinh dưỡng, để trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ.
+ Kháng huyết thanh đơn giá. + Que cấy vô trùng loại 1µl.
+ Phiến kính lõm 24 giếng, bông cồn, nước sinh lý, đèn cồn. - Tiến hành:
+ Trên phiến kính lõm 24 giếng, nhỏ vào một giọt kháng huyết thanh, sau đó dùng que cấy vô trùng loại 1µl lấy 1 vòng vi khuẩn trên môi trường thạch dinh dưỡng, hòa tan trong kháng huyết thanh.
- Đọc kết quả:
+ Phản ứng dương tính khi có sự hình thành các hạt ngưng kết li ti phân bố đều sau 30 giây khi cho kháng huyết thanh.
+ Phản ứng âm tính khi huyết dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh không có hiện tượng ngưng kết, huyễn dịch vẩn đục đều.
+ Trong trường hợp nếu vi khuẩn có khả năng tự ngưng kết (tức là khi cho vi khuẩn hòa với nước muối sinh lý có hình thành ngưng kết nhiều hoặc ít) thì chủng này được coi là tự ngưng kết và không thử nghiệm tiếp theo để phát hiện kháng nguyên nữa.
Khi xác định kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella phải nuôi cấy vi khuẩn vào các môi trường để tạo các pha riêng biệt của kháng nguyên H.
Cách bộc lộ các pha của kháng nguyên H:
- Cấy vi khuẩn cần định type vào môi trường thạch dinh dưỡng (được đổ nghiêng trong ống nghiệm) để tạo pha 1.
- Cấy vi khuẩn vào môi trường thạch Gard (thạch có bổ sung kháng huyết thanh nhằm ức chế pha 1) để tạo ra pha 2 của kháng nguyên H.
Tiến hành định type theo bảng định type huyết thanh học của vi khuẩn
Salmonella theo sơ đồ của Kauffman - White (1972) [34].
3.4.5. Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được Salmonella phân lập được
Từ môi trường ta đã phân lập ở trên, chọn khuẩn lạc nghi Salmonella, kiểm tra hình thái, kích thước 0,4 - 0,6 × 1 - 3µm, không có giáp mô, không sản sinh nha bào, di động được do có lông, từ 7 - 12 lông (trừ Salmonella
pollorum và Salmonella gallinarum), bắt màu Gram âm.
Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là: lên men đường glucose (+), lactose (-), manitol (+), H2S (+), Indole (-), urease (-), catalase (+).
- Kiểm tra khả năng sinh Indole của vi khuẩn:
Phương pháp tiến hành: Lấy khuẩn lạc từ đĩa thạch đã cấy thuần vào môi trường Nutrient Broth, bồi dưỡng trong tủ ấm ở 37oC trong 18 - 24 giờ, vi khuẩn sẽ sinh trưởng, phát triển và sản sinh Indole (nếu có). Tiến hành kiểm tra bằng cách nhỏ giọt 2 - 3 giọt dung dịch Kovac’s vào ống nghiệm.
Đọc kết quả:
+ Phản ứng dương tính: Trên bề mặt môi trường xuất hiện một vòng nhẫn màu đỏ tím hay màu hồng (đó là phản ứng kết hợp giữa Kovac’
s màu cafe và Indole không màu).
+ Phản ứng âm tính: Không có sự thay đổi màu. - Phản ứng catalase:
Phương pháp tiến hành: Lấy một phiến kính sạch, dùng que cấy cẩn thận lấy một phần của khuẩn lạc đặt lên giữa phiến kính. Nhỏ một giọt hydrogen peroxidaza (H2O2) lên vùng có khuẩn lạc.
Đọc kết quả: Phản ứng được cho là dương tính nếu ngay sau khi nhỏ chất phản ứng, bọt khí được hình thành. Ngược lại không có bọt khí hình thành, kết quả âm tính.
- Sản sinh urease:
Phương pháp tiến hành: Dùng que cấy vòng lấy lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạc của chủng thuần vào ống chứa 3ml môi trường Urea Broth vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn để ở 37oC trong 24 giờ.
Đọc kết quả: Phản ứng là dương tính khi môi trường chuyển từ màu vàng cam sang màu đỏ cánh sen. Khi môi trường giữ nguyên màu vàng cam là âm tính.
- Phản ứng oxidase:
Phương pháp tiến hành: Lấy vi khuẩn từ môi trường Nutrient Agar đặt lên giấy thấm. Nhỏ thuốc thử TMPD (Tetramethyl - ρ - phenylenediamine). Quan sát sau 30 giây.
Đọc kết quả:
+ Phản ứng dương tính: Sinh khối chuyển màu xanh. +Phản ứng âm tính: Sinh khối vẫn màu trắng.
- Khả năng dung huyết:
Phương pháp tiến hành: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ đĩa thạch đã nuôi cấy, cấy ria lên đĩa thạch máu. Sau đó để ở 37oC trong 24 giờ, quan sát sự thay đổi trên đĩa thạch.
Đọc kết quả: Có 3 kiểu dung huyết:
+ Dung huyết hoàn toàn: Vòng dung huyết trong vào rõ.
+ Dung huyết không hoàn toàn: Xung quanh và dưới khuẩn lạc chuyển đục và có màu khác.
+ Không dung huyết: Hoàn toàn không dung huyết.