Việc khảo sát hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn được thực hiện tại Bộ Môn Vi sinh – Đại Học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh .
2.3.3.1. Vật liệu
Môi trường tăng sinh vi khuẩn: Nutrient Broth (NB), Tryptic Soy Broth (TSB), Trypticase soy agar (TSA).
Môi trường tăng sinh vi nấm: Sabouraud dextrose agar (SAB). Môi trường thử nghiệm kháng sinh: Thạch Mueller-Hinton (MHA).
Các môi trường này được cung cấp dưới dạng bột khô, khi sử dụng hòa tan vào nước theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các môi trường thạch phải đun nóng cho thạch tan. Tiệt trùng ở 121 oC. Môi trường đã hấp tiệt trùng nhưng chưa sử dụng được bảo quản trong tủ lạnh ở 2-8 oC.
Hoá chất
Dimethyl sulfoxid (DMSO) mua từ công ty Merck. Vi khuẩn thử nghiệm
Vi khuẩn Gr (-):
1. Escherichia coli ATCC 25922.
2. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Vi khuẩn Gr (+)
3. Streptococcus faecalis ATCC 29212.
4. Staphylococcus aureus ATCC 29213.
5. Staphylococcus aureus đề kháng meticillin (MRSA) ATCC 43300.
6. Bacillus subtilis PY 79.
Vi nấm thử nghiệm Nấm men
1. Candida albicans ATCC10231.
Nấm sợi
2. Aspergilus niger ATCC 16404
2.3.3.2. Định tính khả năng kháng khuẩn của các chất thử nghiệm
Chuẩn bị
Môi trường hoạt hóa vi khuẩn thử nghiệm: NB hay TSB.
Môi trường thử nghiệm: MHA. Môi trường MHA được nấu chảy và đổ hộp sao cho có được lớp thạch dày khoảng 3-4 mm. Nếu bề mặt thạch bị đọng nước cần ủ
khô mặt thạch bằng cách mở nắp hộp và để trong tủ ấm 35-37 oC trong 15-30 phút.
Vi khuẩn thử nghiệm
- Cấy ria vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 oC trong 24 giờ.
- Lấy 3-5 khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào môi trường TSB. - Ủ từ 2-6 giờ ở 37 oC để hoạt hóa vi khuẩn.
- Chỉnh độ đục vi khuẩn bằng nước muối sinh lý hoặc TSB, sao cho mật độ thu được tương đương với McFarland 0,5 - là khoảng 1,5 x 108 CFU/ml
- Vi khuẩn đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút. Chất thử
- Chất thử được hòa tan trong DMSO để đạt nồng độ cuối cùng là 2048 μg/ml.
Tiến hành
- Dùng que bông vô trùng nhúng vào huyền trọc vi khuẩn đã chuẩn bị, ép que trên thành ống cho ráo nước, sau đó trải đều trên mặt thạch. Lập lại 3 lần, mỗi lần xoay hộp 60 o.
- Để hộp mở nắp trong tủ ấm 3-5 phút cho ráo mặt.
- Đục lỗ đường kính 3 mm trong bản thạch bằng dụng cụ tiệt trùng. - Chất thử được nhỏ vào trong lỗ khoảng 10 μl.
- Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch. - Ủ hộp thạch trong tủ ấm 35-37 oC trong 16-18 giờ. Nếu vi khuẩn là MRSA thì
ủ trong 24 giờ.
Đọc kết quả
Lỗ chứng chứa DMSO không ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
Chất thử có khả năng kháng khuẩn khi xung quang lỗ có vòng vô khuẩn.
Hình 2.2: Vòng vô khuẩn trên đĩa cấy vi khưẩn
2.3.3.3. Định tính khả năng kháng nấm của các chất thử nghiệm
Sử dụng phương pháp khuếch tán trong thạch.
Chuẩn bị
Môi trường hoạt hóa nấm: SAB
Môi trường thử nghiệm: MHA + 2 % glucose. Môi trường được nấu chảy và đổ hộp sao cho có được lớp thạch dày khoảng 3-4 mm. Nếu bề mặt thạch bị đọng nước cần ủ khô mặt thạch bằng cách mở nắp hộp và để trong tủ ấm 35-37 oC trong 15-30 phút.
Vi nấm thử nghiệm
- Cấy ria nấm trên môi trường thạch SAB, ủ ở 37 oC trong 24-48 giờ đối với
C.albicans và ủ ở 30 oC trong 48-72 giờ đối với A.niger
- Chỉnh độ đục nấm bằng nước muối sinh lý, sao cho mật độ thu được tương đương với McFarland 0,5, là khoảng 1-5 x 106 CFU/ml
Nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút. Chất thử
- Chất thử được hòa tan trong DMSO để đạt nồng độ cuối cùng là 2048 μg/ml Phần tiến hành và đọc kết quả thực hiện giống với phần định tính khả năng
kháng khuẩn. Chỉ lưu ý nhiệt độ ủ hộp thạch sau khi đã khuếch tán chất thử là 35-37 oC đối với C.albicans và 30 oC đối với A.niger trong 24-48 giờ.
2.3.3.4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của chất thử
Phương pháp
Phương pháp pha loãng hay phương pháp pha loãng bán định lượng (Semi – quantitative dilution test)
Những thử nghiệm này nói chung được gọi là thử nghiệm MIC. Kết quả được thể hiện bằng nồng độ chất thử tối thiểu (μg/ml) có khả năng ức chế sự mọc của vi khuẩn.
Nguyên tắc: chất thử được pha loãng thành một dãy nồng độ từ thấp tới cao theo cấp số nhân trong môi trường nuôi cấy. Mỗi nồng độ chất thử được cấy một lượng vi khuẩn nhất định và được nuôi cấy trong vòng 18-24 giờ. Nồng độ chất thử thấp nhất có thể ức chế được sự phát triển của vi khuẩn (môi trường không đục hoặc vi khuẩn không mọc trên mặt thạch) được gọi là giá trị MIC.
Môi trường
- Môi trường MHA được phân chia vào các ống nghiệm với một thể tích chính xác, để đảm bảo các đĩa thạch có độ dày đồng đều; hấp tiệt trùng ở 121 oC, 15 phút.
- Chất thử nghiệm được cân chính xác và pha thành dung dịch mẹ trong DMSO. Khi sử dụng pha loãng bằng môi trường thử nghiệm hoặc pha trực tiếp với môi
trường thử nghiệm sao cho tạo thành giai nồng độ trong môi trường thử nghiệm (có nồng độ sau bằng ½ nồng độ trước) như sau: 1024 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/ml, 8 μg/ml, 4 μg/ml, 2 μg/ml. Khi pha chất thử vào môi trường phải đảm bảo nồng độ DMSO nằm trong khoảng từ 2-5 % nhằm tránh việc nồng độ DMSO cao sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn thử nghiệm.
- Cho chất thử vào môi trường đã để nguội về 45-50 oC, lắc đều để đạt được nồng độ cuối cần thử nghiệm
- Đổ vào đĩa petri, độ dày thạch khoảng 3-4 mm.
Chuẩn bị vi khuẩn
- Cấy ria vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 oC trong 24 giờ.
- Lấy 3-5 khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào môi trường TSB. - Ủ từ 2-6 giờ ở 37 oC để hoạt hóa vi khuẩn.
- Chỉnh độ đục vi khuẩn bằng nước muối sinh lý hoặc TSB, sao cho mật độ thu được tương đương với McFarland 0,5, là khoảng 1,5 x 108 CFU/ml.
- Pha loãng dịch vi khuẩn 10 lần để đạt mật độ khoảng 1,5 x 107 CFU/ml. Vi khuẩn đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút.
Tiến hành
- Đĩa thạch được đánh số cho vị trí các chủng vi khuẩn.
- Làm khô mặt đĩa thạch có chất thử và đĩa chứng không có chất thử.
- Cho 1-2 μl huyền phù dịch vi khuẩn lên đĩa để đạt được mật độ vi khuẩn trên thạch là 104 CFU/ml.
- Để yên khoảng 15 phút để vết chấm khô.
- Lật ngược đĩa thạch đã cấy và ủ trong tủ ấm ở 37 oC trong 16-18 giờ. Đối với MRSA phải ủ trong 24 giờ.
Hình 2.3: Sơ đồ thử MIC
Đọc kết quả
- Kết quả chỉ có giá trị khi vi khuẩn trong mẫu chứng mọc bình thường.
- Đặt đĩa thạch trên một bề mặt sẫm màu, không phản xạ ánh sáng, quan sát sự tạo thành khóm của vi khuẩn thử nghiệm. Tìm đĩa có nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tạo khóm, nồng độ của đĩa thạch này là MIC của chất thử đối với vi khuẩn thử nghiệm.
- Các khóm đơn lẻ hoặc vết mờ do đầu cấy để lại không được tính.
- Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp, mẫu cấy có thể đã bị nhiễm và thử nghiệm phải được thực hiện lại.
2.3.3.5. Xác định MIC đối với vi nấm của chất thử
Về mặt nguyên tắc, chuẩn bị môi trường, chất thử và tiến hành thử nghiệm là giống nhau giữa thử nghiệm trên vi khuẩn và vi nấm. Phần này chúng tôi chỉ nêu những điểm khác trong phần thử nghiệm của vi nấm.
Môi trường
Môi trường MHA + 2% glucose được phân chia vào các ống nghiệm với một thể tích chính xác, để đảm bảo các đĩa thạch có độ dày đồng đều; hấp tiệt trùng ở 121 oC trong 15 phút.
Chuẩn bị vi nấm
- Cấy ria nấm trên môi trường thạch SAB, ủ ở 37 oC trong 24-48 giờ đối với
C.albicans và ủ ở 30 oC trong 48-72 giờ đối với A.niger
- Chỉnh độ đục nấm bằng nước muối sinh lý, sao cho mật độ thu được tương đương với McFarland 0,5, là khoảng 1-5 x 106 CFU/ml
Nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút
Tiến hành
- Đĩa thạch được đánh số cho vị trí các chủng nấm.
- Làm khô mặt đĩa thạch có chất thử và đĩa chứng không có chất thử.
- Cho huyền phù nấm lên đĩa để đạt được mật độ nấm trên thạch là 104 CFU/ml đối với A.niger và 103 CFU/ml đối với C.albicans.
- Để yên khoảng 15 phút để vết chấm khô.
- Lật ngược đĩa thạch đã cấy và ủ trong tủ ấm ở 37 oC đối với C.albicans và 30 oC đối với A.niger trong 24-48 giờ.
Đọc kết quả
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU