2.2.1. Các hóa chất cơ bản dùng trong nghiên cứu
Các hóa chất dùng cho phản ứng tổng hợp có nguồn gốc từ các nhà phân phối Acros, Merck và Trung Quốc .
Bảng 2.1: Các nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Hàm lượng (%)
1 Acid 5-bromosalicylic Acros – Bỉ 98
2 Acid 5-clorosalicylic Acros – Bỉ 98
3 Acid 5-iodosalicylic Acros – Bỉ 97
4 Acid 5-nitrosalicylic Acros – Bỉ 99
5 2-clorobenzaldehyd Acros – Bỉ 99 6 4-clorobenzaldehyd Acros – Bỉ 98,5 7 2,4-diclorobenzaldehyd Acros – Bỉ 98 8 4-fluorobenzaldehyd Acros – Bỉ > 98 9 2-furaldehyd Acros – Bỉ 99 10 4-N,N-dimethylaminobenzaldehyd Acros – Bỉ > 99 11 2-nitrobenzaldehyd Merck – Đức 99 12 3-nitrobenzaldehyd Merck – Đức 98 13 4-nitrobenzaldehyd Merck – Đức 98 14 4-methoxybenzaldehyd Merck – Đức 97 15 2,3-dimethoxybenzaldehyd Merck – Đức 97 16 3,4-dimethoxybenzaldehyd Merck – Đức 98 17 3,4,5-trimethoxybenzaldehyd Merck – Đức 98 18 3-hydroxy-4-methoxybenzaldehyd Merck – Đức 99
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Hàm lượng (%)
20 Phosphorus pentasulfid Merck – Đức 27,8 – 28,9
21 Bản mỏng Silicagel 60 F254 Merck – Đức
22 Acid acetic băng Trung Quốc 99
23 Acid sulfuric Trung Quốc 95 – 98
24 Acid hydrocloric Trung Quốc 34 – 36
25 Carbondisulfid Trung Quốc 97
26 Dioxan Trung Quốc 98,5
27 Hydrazin hydrat Trung Quốc 64
28 Methanol Trung Quốc 99,5
Các hóa chất dùng cho sắc ký lớp mỏng, xác định cấu trúc và các thông số đặc trưng là các loại hóa chất tinh khiết dành cho phân tích của các hãng Merck, Prolabo… bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 của Merck.
2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị
Các dụng cụ thủy tinh dùng trong tổng hợp hóa học.
Các máy dùng cho việc xác định cấu trúc và các thông số đặc trưng cho sản phẩm:
Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt của Trung Quốc Máy đo nhiệt độ nóng chảy: SMP3.
Máy đo quang phổ UV - Vis: UV-2010 Spectrophotometer / HITACHI. UV-3200 Spectrophotometer / LABOMET Máy đo quang phổ hồng ngoại: IR FTIR 8101 / SHIMADZU
IR FTIR Alpha / BRUKER. Máy đo phổ cộng hưởng từ: BRUKER AV 500MHz.
2. 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.3.1. Tổng hợp 2.3.1. Tổng hợp
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ quy trình tổng hợp các dẫn chất 3-salicylamidothiazolidin
Các dẫn chất acid salicylic
Các ester methyl salicylat
Các salicyl hydrazid 3-(5-halogeno / nitro/salicylamido)rhodanin 5-aryliden-3-(5-halogeno / nitro / salicylamido)rhodanin 3-salicylamido- thiazolidin- 2,4-dion 3-(5-halogeno / nitro/salicylamido)thiorhodanin CH3OH / H2SO4 H2N-NH2. H2O 1- CS2/CH3OH 2- CH2ClCOONa 3- HCl / t oC (CH3)2SO4/H2O Ar-CHO P2S5 / Dioxan 5-aryliden-3-salicylamido- thiazolidin-2,4-dion Ar-CHO
2.3.1.1. Phản ứng ester hóa
Từ nguyên liệu là các dẫn chất acid halogeno / nitrosalicylic, tổng hợp các ester tương ứng theo phản ứng:
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng ester hóa
- Dung môi: methanol vừa làm dung môi vừa làm nguyên liệu phản ứng. - Chất xúc tác: H2SO4 đđ .
- Nhiệt độ và thời gian phản ứng: bình phản ứng được đun cách thủy trong thời gian 6-8 giờ.
2.3.1.2. Phản ứng hydrazid hóa
Phản ứng được thực hiện trong các điều kiện gần giống nhau cho tất cả các loại dẫn chất ester của acid salicylic tổng hợp được ở phần trên.
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng - pH môi trường: môi trường base
- Dung môi: hydrazin hydrat vừa là dung môi vừa là chất tham gia phản ứng. - Nhiệt độ: 110-120 oC
- Thời gian: 3-4 giờ.
2.3.1.3. Phản ứng đóng vòng tạo các dẫn chất 3-salicylamidorhodanin tương ứng
Các sản phẩm hydrazid tạo thành được đóng vòng tạo rhodanin với những điều kiện phản ứng gần giống nhau. Phản ứng đóng vòng được tiến hành qua ba giai đoạn.
Tổng hợp muối amonium dithiocarbamat của các hydrazid
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng
- pH môi trường: phản ứng xảy ra tốt nhất trong môi trường kiềm yếu.
- Dung môi: có thể dùng dung môi là methanol. Các hydrazid phải được hòa tan hoàn toàn thì phản ứng ghép với CS2 mới có thể xảy ra tốt.
- Nhiệt độ: khoảng 0-5 oC.
- Thời gian: Phản ứng xảy ra chậm, giai đoạn đầu thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 0-5 oC trong 2 giờ; sau đó cần để yên hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 18-20 oC trong khoảng 16-18 giờ
- Điều kiện khác: sự khuấy trộn liên tục trong giai đoạn đầu
Tổng hợp các dẫn chất natri (N-salicylamidothiocarbamoyl)mercaptoacetat
Yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phản ứng
- pH môi trường: phản ứng ghép xảy ra dễ dàng hơn trong môi trường kiềm hoặc trung tính.
- Thời gian và nhiệt độ phản ứng: ở nhiệt độ lạnh phản ứng ghép khó xảy ra, nếu thực hiện ở nhiệt độ cao dithiocarbamat bị phân hủy trước khi phản ứng xảy ra. Phản ứng tốt nhất ở nhiệt độ 25 oC trong khoảng 18-24 giờ.
Đóng vòng tạo các dẫn chất 3-salicylamidorhodanin
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phản ứng
- pH môi trường: phản ứng đóng vòng xảy ra trong dung dịch HCl đđ. - Thời gian và nhiệt độ: 90-95 oC trong thời gian 30 phút.
2.3.1.4. Tổng hợp các dẫn chất 5-aryliden của 3-salicylamidorhodanin
Với Ar-CHO là các aldehyd thơm hoặc aldehyd dị vòng tham gia vào phản ứng ngưng tụ.
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng
- Dung môi, chất xúc tác: phản ứng xảy ra trong môi trường là acid acetic băng với chất xúc tác là các amin bậc 1 hoặc 2 như dimethylamin.
- Nhiệt độ: nhiệt độ thích hợp cho phản ứng là 110-120 oC.
- Thời gian: Phản ứng tiến hành trong 4 giờ kèm khuấy trộn liên tục.
2.3.1.5. Tổng hợp 3-salicylamidothiazolidin-2,4-dion và các dẫn chất
Phản ứng xảy ra ở nhiệt độ 95-100 oC sản phẩm là dẫn chất mercapto có màu đỏ nâu.
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng
- Nhiệt độ phản ứng: nhiệt độ thích hợp của phản ứng là 95-100 oC. - Thời gian: 2 giờ.
- Tỉ lệ mol giữa 3-salicylamido rhodanin và dimethylsulfat: tỉ lệ mol thích hợp để phản ứng xảy ra hoàn toàn là 1:3.
Phản ứng tạo 3-salicylamidothiazolidin-2,4-dion
Dẫn chất mercapto bị thủy phân thành thiazolidin-2,4-dion
Sau khi thủy phân dẫn chất mercapto sẽ cho 3-salicylamidothiazolidin 2,4-dion.
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng
- Nhiệt độ và thời gian: phản ứng thủy phân xảy ra ở nhiệt độ 98-100 oC. - Thời gian: 2 giờ, nếu nhiệt độ thấp hơn phản ứng xảy ra lâu hơn.
Tổng hợp các dẫn chất 5-aryliden-3-salicylamidothiazolidin-2,4-dion
Như đã đề cập ở phần tổng quan, H ở vị trí số 5 khá linh động nên thiazolidin-2,4-dion phản ứng với các hợp chất aldehyd thơm tạo thành các 5-aryliden, nhưng do độ âm điện của O lớn hơn S do đó gây ra hiệu ứng rút
điện tử mạnh hơn S , từ đó làm cho hoạt tính ái nhân của ion enolat tạo thành giảm, nên phản ứng xảy ra khó hơn so với 3-salicylamido rhodanin.
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng
- Dung môi, chất xúc tác: phản ứng xảy ra trong môi trường khan với chất xúc tác là các amin bậc 1 hoặc 2 như dimethylamin.
- Nhiệt độ và thời gian: nhiệt độ thích hợp cho phản ứng là 110-120 oC trong 6-7 giờ.
2.3.1.6. Tổng hợp các dẫn chất 3-salicylamidothiorhodain
Phản ứng được tiến hành trong môi trường dioxan khan với tác nhân phản ứng P2S5.
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng
- Dung môi, chất xúc tác: phản ứng xảy ra trong môi trường dioxan khan. - Nhiệt độ: phản ứng xảy ra ở nhiệt độ 95-100 oC
- Thời gian: thời gian phản ứng khoảng 30 phút.
2.3.2. Xác định độ tinh khiết và cấu trúc
2.3.2.1. Định tính bằng phương pháp hóa học
Nhóm –OH phenol
Các dẫn chất của acid salicylic cho phức màu với dung dịch FeCl3, do nhóm OH phenol tạo phức với FeCl3.
Nhóm chức acid -COOH
Các chất có nhóm chức acid COOH , khi cho tác dụng với NaHCO3 sẽ sủi bọt khí.
R-COOH + NaHCO3 → RCOONa + H2O + CO2↑
Dẫn bọt khí qua bình chứa dung dịch Ca(OH)2, khí tạo thành làm đục dung dịch trong bình
CO2 + Ca(OH)2 → CaCO3 ↓ + H2O
Nhóm chức ester
Các ester không tạo bọt khí khi cho tác dụng với natri bicarbonat.
Khi bị thủy phân bằng cách đun nóng trong NaOH 10 %, sau đó acid hóa trở lại, sản phẩm vừa tạo thành sẽ sủi bọt khí trong NaHCO3.
R-COOR’ + NaOH → RCOONa + R’OH
RCOONa + HCl → RCOOH + NaCl
RCOOH + NaHCO3→ RCOONa + H2O + CO2↑
CO2 + Ca(OH)2 → CaCO3 ↓ + H2O
Nhóm chức hydrazid
Các chất có chứa chức hydrazid có tính khử sẽ cho phản ứng tráng gương với AgNO3 .
R-CONH-NH2 + AgNO3 / NH4OH → RCOOH + NH4NO3 + Ag↓ + NH3
Nhóm thế halogen
Vô cơ hóa sản phẩm trong dung dịch KOH 17 %, rửa cắn, nước rửa thêm HNO3 10 % (pH khoảng bằng 3), thêm dung dịch AgNO3 1 % → tủa từ trắng đến vàng nhạt AgX. [10]
KX + AgNO3 → AgX↓ + KNO3 với : X = Cl; Br; I
Nhân rhodanin
Có thể định tính nhân rhodanin bằng phản ứng ngưng tụ với PDAB tạo sản phẩm có màu đỏ đặc trưng.
Các sản phẩm vừa tổng hợp được hòa trong acid acetic băng, thêm vài tinh thể PDAB và 2 giọt dimethylamin, đun nóng → xuất hiện tủa màu đỏ đậm.
Nhóm –NO2
Đun sản phẩm với HCl và bột kẽm trong 3 phút, để nguội và làm lạnh đến 0-5 oC, cho thêm dung dịch NaNO2 0,1N lắc đều. Sau đó cho thêm vài giọt
β- Naphtol / NaOH → xuất hiện màu đỏ cam của phẩm màu azoic.
Tủa đỏ cam
2.3.2.2. Xác định nhiệt độ nóng chảy
Nhiệt độ nóng chảy được đo trên máy đo nhiệt độ nóng chảy STUART - SMP3. Nhiệt độ được đo 3 lần tính kết quả trung bình.
Sản phẩm tạm coi là tinh khiết khi nhiệt độ nóng chảy giữa hai lần tinh chế chênh lệch không quá ± 0,5 oC.
2.3.2.3. Sắc ký lớp mỏng
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc ký lớp mỏng Tiến hành trên bản mỏng Silicagel 60 F254 tráng sẵn (Merck).
Các hệ dung môi:
Dung môi A: cloroform - acid acetic (9 :1) Dung môi B: cloroform - ethyl acetat (3 : 7)
Dung môi C: cloroform - ethyl acetat - methanol (20 : 20 : 2) Dung môi D: toluen - ethyl acetat - methanol (31 : 8 : 1) Dung môi E: toluen - ethyl acetat - methanol (15 : 4 : 1) Dung môi F: toluen - ethyl acetat - methanol (15 : 4 : 2,5) Dung môi G: n-hexan - ethyl acetat (1 : 1)
Dung môi H: n-hexan - ethyl acetat (2 : 1) Dung môi I: n-hexan - aceton (5 : 2) Dung môi J: cloroform - methanol (40:1)
Dung môi K: cloroform - ethyl acetat - acid acetic (10 : 5 : 1) Dung môi L: cloroform - ethanol - acid acetic (20 : 2 : 1) Dung môi M: cloroform - ethyl acetat - acid acetic (9 : 4 : 1) Dung môi N: cloroform - methanol - amoniac (10 : 2 : 1) Dung môi O: cloroform - aceton - amoniac (10 : 2 : 1) Dung môi P: cloroform - ethyl acetat - amoniac (8 : 4 : 1) Dung môi Q: cloroform - methanol (15 : 3)
Dung môi R: cloroform - ethyl acetat - methanol (10 : 10 : 4) Dung môi S: cloroform - aceton - methanol (10 : 10 : 4)
Mẫu thử: dung dịch mẫu thử có nồng độ khoảng 2 mg/ml trong ethanol tuyệt đối, chấm khoảng 5 μl.
Thứ tự vết chấm trên bản mỏng (hình 2.1):
1 – Sản phẩm
2– Hỗn hợp sản phẩm và nguyên liệu. 3 – Nguyên liệu.
Phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm.
Hình 2.1: sắc ký đồ
2.3.2.4. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại được đo trên máy FTIR 8101 của hãng Shimadzu và máy FTIR Alpha của hãng Bruker, với kỹ thuật dập viên KBr.
Bảng 2.2 : Đỉnh đặc trưng trong phổ IR của các dẫn chất thiazolidin
Đỉnh hấp thu (cm-1) Kiểu dao động Nhóm chức
1700-1750 1600-1700 1400-1600 1010-1105 v N-C=O v C=O v C=C v C=S Nhân rhodanin Amid Nhân thơm Nhân rhodanin 2.3.2.5. Phổ tử ngoại (UV)
Mẫu thử được pha loãng trong ethanol tuyệt đối (Prolabo). Quét phổ trên máy UV-2010 Spectrophotometer của hãng HITACHI và máy UV-3200 Spectrophotometer của hãng LABOMET
Các chất tổng hợp được dự kiến đều có nhân thơm nên thường cho dải hấp thu ở vùng 200-400 nm.
2.3.2.6. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H NMR và 13C NMR)
Phổ 1H NMR được đo trên máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AV - 500 MHz (tần số 500 MHz).
Bảng 2.3: Dịch chuyển hóa học của các proton thuộc dẫn chất thiazolidin
Chuyển dịch hóa học (ppm) Vị trí của proton
8,0-6,5 -C6H5
4,5-4,0 >CH2
4,0-3,8 C6H5-OCH3
3,0-2,8 C6H5-N(CH3)2
Phổ 13C NMR được đo trên máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV - 500 MHz (tần số 125 MHz).
Bảng 2.4: Dịch chuyển hóa học của các carbon thuộc dẫn chất thiazolidin
Chuyển dịch hóa học (ppm) Vị trí của carbon
170-200 >C=S (thiazolidin) 165-170 >C=O 128,5 ± 35 -C=C- (nhân thơm) 55,0-60,0 C6H5-OCH3 40,0-45,0 C6H5-N(CH3)2 2.3.2.7. Khối phổ
Khối phổ các chất được đo trên máy FT- ICR- MS hãng VARIAN. Ion hóa mẫu theo phương pháp ESI (electrospray ionization).
2.3.3. Khảo sát hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn
Việc khảo sát hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn được thực hiện tại Bộ Môn Vi sinh – Đại Học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh .
2.3.3.1. Vật liệu
Môi trường tăng sinh vi khuẩn: Nutrient Broth (NB), Tryptic Soy Broth (TSB), Trypticase soy agar (TSA).
Môi trường tăng sinh vi nấm: Sabouraud dextrose agar (SAB). Môi trường thử nghiệm kháng sinh: Thạch Mueller-Hinton (MHA).
Các môi trường này được cung cấp dưới dạng bột khô, khi sử dụng hòa tan vào nước theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các môi trường thạch phải đun nóng cho thạch tan. Tiệt trùng ở 121 oC. Môi trường đã hấp tiệt trùng nhưng chưa sử dụng được bảo quản trong tủ lạnh ở 2-8 oC.
Hoá chất
Dimethyl sulfoxid (DMSO) mua từ công ty Merck. Vi khuẩn thử nghiệm
Vi khuẩn Gr (-):
1. Escherichia coli ATCC 25922.
2. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Vi khuẩn Gr (+)
3. Streptococcus faecalis ATCC 29212.
4. Staphylococcus aureus ATCC 29213.
5. Staphylococcus aureus đề kháng meticillin (MRSA) ATCC 43300.
6. Bacillus subtilis PY 79.
Vi nấm thử nghiệm Nấm men
1. Candida albicans ATCC10231.
Nấm sợi
2. Aspergilus niger ATCC 16404
2.3.3.2. Định tính khả năng kháng khuẩn của các chất thử nghiệm
Chuẩn bị
Môi trường hoạt hóa vi khuẩn thử nghiệm: NB hay TSB.
Môi trường thử nghiệm: MHA. Môi trường MHA được nấu chảy và đổ hộp sao cho có được lớp thạch dày khoảng 3-4 mm. Nếu bề mặt thạch bị đọng nước cần ủ
khô mặt thạch bằng cách mở nắp hộp và để trong tủ ấm 35-37 oC trong 15-30 phút.
Vi khuẩn thử nghiệm
- Cấy ria vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 oC trong 24 giờ.
- Lấy 3-5 khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào môi trường TSB. - Ủ từ 2-6 giờ ở 37 oC để hoạt hóa vi khuẩn.
- Chỉnh độ đục vi khuẩn bằng nước muối sinh lý hoặc TSB, sao cho mật độ thu được tương đương với McFarland 0,5 - là khoảng 1,5 x 108 CFU/ml
- Vi khuẩn đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút. Chất thử
- Chất thử được hòa tan trong DMSO để đạt nồng độ cuối cùng là 2048 μg/ml.
Tiến hành
- Dùng que bông vô trùng nhúng vào huyền trọc vi khuẩn đã chuẩn bị, ép que trên thành ống cho ráo nước, sau đó trải đều trên mặt thạch. Lập lại 3 lần, mỗi lần xoay hộp 60 o.
- Để hộp mở nắp trong tủ ấm 3-5 phút cho ráo mặt.
- Đục lỗ đường kính 3 mm trong bản thạch bằng dụng cụ tiệt trùng. - Chất thử được nhỏ vào trong lỗ khoảng 10 μl.
- Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch. - Ủ hộp thạch trong tủ ấm 35-37 oC trong 16-18 giờ. Nếu vi khuẩn là MRSA thì