1.6.1. Xác định nhiệt độ nóng chảy [1]
Đối với chất rắn, việc xác định nhiệt độ nóng chảy là một yêu cầu cần thiết vì nhiệt độ nóng chảy là một thông số đặc trưng của mỗi chất. Ngoài ra nhiệt độ nóng chảy còn là tiêu chuẩn đánh giá mức độ tinh khiết của hợp chất.
1.6.2. Định tính các nhóm chức bằng phương pháp hóa học
Định tính bằng phương pháp hóa học là dựa vào khả năng phản ứng của các nhóm chức trong phân tử để xác định cấu trúc. Đây là phương pháp đơn giản không cần máy móc phức tạp do đó thường được ứng dụng trong kiểm nghiệm và được ghi trong các tài liệu cũng như các dược điển.
Trên phân tử các dẫn chất rhodanin có nhiều nhóm chức có thể định tính bằng các phản ứng hóa học:
OH phenol : xác định bằng FeCl3 [18].
Nhóm chức hydrazid: xác định bằng phản ứng tráng gương [10]. Cl-, I-, Br- : xác định bằng AgNO3 [10], [18].
Nhóm nitro thơm: xác định bằng NaNO2/H+ và naphtol kiềm
Rhodanin : xác định bằng PDAB (paradimethylaminobenzaldehyd) [15], [36]. Chi tiết các phản ứng và tiến hành xem phần phương pháp nghiên cứu, kết quả và bàn luận
Sắc ký là phương pháp vật lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp, xác định độ tinh khiết của sản phẩm tổng hợp. Ngoài ra sắc ký còn có ý nghĩa định tính nếu chất tổng hợp được triển khai so sánh với chất chuẩn trong cùng điều kiện.
1.6.4. Phương pháp quang phổ
Ngày nay các phương pháp quang phổ được ứng dụng rộng rãi để xác định cấu trúc phân tử. Đặc biệt các phương pháp quang phổ đã rút ngắn được rất nhiều thời gian nghiên cứu so với phương pháp hóa học. Đồng thời phương pháp quang phổ cho độ chính xác cao hơn.
1.6.4.1. Quang phổ IR
Phổ hồng ngoại cung cấp các thông tin về dao động của các nhóm chức trong phân tử do đó hiện nay vẫn còn ứng dụng trong việc phân tích cấu trúc phân tử của các hợp chất [1], [5], [8], [58], [89], [100].
Mẫu cần được xử lý cẩn thận trước khi đo phổ. Có ba phương pháp xử lý mẫu:
-Phương pháp dập viên KBr -Phương pháp cặp giò
-Phương pháp dùng cóng đo [3], [94], [98].
1.6.4.2. Quang phổ UV
Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến còn được gọi là phương pháp quang phổ hấp thụ điện tử, là một trong các phương pháp phân tích dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện từ [1], [5], [21], [63], [92].
Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại khả kiến phụ thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử. Phổ tử ngoại chỉ áp dụng để xác định cấu trúc của các phân tử có hệ thống nối đôi [44], [58], [94].
1.6.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được thực hiện dựa trên nguyên tắc tìm điều kiện cộng hưởng trong một từ trường ngoài cố định hoặc tại một tần số cố định [5], [12], [27], [28].
Phổ NMR (1H, 13C, 19F, 31P, 2D,…) cho phép xác định cấu trúc phân tử (công thức khai triển và cấu trúc lập thể). Trong đó, phổ 1H-NMR (phổ proton) và 13C-NMR (phổ carbon) thường được sử dụng nhất trong việc xác định cấu trúc các chất tổng hợp [27], [32], [33], [44], [58], [67], [84].
1.6.4.4. Khối phổ
Khối phổ là một phương pháp phân tích không dùng bức xạ điện từ. Kỹ thuật khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số giữa khối lượng và điện tích của một ion (m/z) [5], [11].
1.7. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHẤT TỔNG HỢP 1.7.1. Xác định hoạt tính kháng khuẩn 1.7.1. Xác định hoạt tính kháng khuẩn
1.7.1.1. Phương pháp khuếch tán trên bản thạch [1], [6].
Phương pháp này có hai cách tiến hành
Phương pháp đặt giấy
Thường áp dụng với kháng sinh có tác dụng trên vi khuẩn (còn gọi là phương pháp kháng sinh đồ là thử nghiệm đi trước thử nghiệm tìm MIC).
Nhược điểm của phương pháp là nếu thuốc thử và hóa chất khó khuếch tán vào bản thạch sẽ làm sai lệch kết quả và phải tính toán phức tạp.
Phương pháp đục lỗ
Với phương pháp này cần phải thăm dò để tìm ra một dung dịch đệm và môi trường để thuốc khuếch tán tốt. Phương pháp này đòi hỏi thời gian và kinh nghiệm.
1.7.1.2. Phương pháp pha loãng
Pha loãng trong môi trường lỏng
Trong một dãy các ống nghiệm có chứa môi trường đã được pha sẵn chất thử nghiệm ở những nồng độ khác nhau, dùng pipet vô khuẩn để đưa vi khuẩn thử nghiệm vào. Đem ấp ở 37 oC trong vòng 18-24 giờ. Nếu có tác dụng kháng khuẩn, chất thử sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường lỏng. Phương pháp này có ưu điểm là nhanh gọn, chính xác, dễ thực hiện nhưng chỉ áp dụng được đối với chất tan được trong nước.
Pha loãng trên bản thạch
Chất thử nghiệm được pha loãng ở các nồng độ khác nhau trong môi trường nuôi cấy có chứa thạch đã được hấp tiệt trùng, đổ vào hộp petri, chờ thạch đông. Tiếp tục dùng micropipet lấy một lượng vi khuẩn theo qui định đưa lên bản thạch ở những vị trí đã được đánh dấu sẵn. Đem ấp ở 37 oC trong vòng 18-24 giờ. Nếu có tác dụng kháng khuẩn, trên bản thạch sẽ xuất hiện vòng vô khuẩn. Phương pháp này thích hợp cho những chất khó tan trong nước.
1.7.2. Xác định hoạt tính kháng nấm
Các phương pháp: tương tự phần kháng khuẩn.
1.8. ỨNG DỤNG CỦA THIAZOLIDIN VÀ CÁC DẪN CHẤT 1.8.1. Ứng dụng trong phân tích định tính và định lượng 1.8.1. Ứng dụng trong phân tích định tính và định lượng
Rhodanin và các dẫn chất 5-methylen của rhodanin có thể kết tủa với các kim loại nặng. Do đó rhodanin và dẫn chất thường được sử dụng trong hóa phân tích, làm thuốc thử để phát hiện các ion kim loại như Ag+, Au+, Cu2+, Hg2+, Pd2+, Ni2+, Co2+ v.v.… với độ nhạy khá cao[35], [47], [48], [72], [82], [85], [90].
5-(3-indolylmethylen)rhodanin và 5-pyridylmethylenrhodanin đã được dùng làm thuốc thử trong việc xác định các kim loại bằng sắc ký giấy.
5-(3-indolylmethylen)rhodanin
Ngoài ra có thể dùng 5-(p-dimethylaminobenzyliden)rhodanin để phát hiện những lượng nhỏ chất oxy hóa như acid ascorbic với sự hiện diện của đồng sulfat và natri pyrophosphat [36].
5-(p-dimethylaminobenzyliden)rhodanin
5-(3-,4-dihydroxybenziliden)rhodanin có thể tạo tủa màu với các dẫn chất của kim loại titan (Ti) [36].
5-(3-,4-dihydroxybenziliden)rhodanin
Bên cạnh ứng dụng trong phân tích định tính, 4-thiazolidinon và các dẫn chất như các rhodanin còn thường được dùng trong phân tích định lượng.
5-(p-diethylaminobenzyliden)rhodanin dùng định lượng vàng, platin bằng phương pháp so màu với độ nhạy cao, cho phép xác định những hàm lượng vàng khá nhỏ [85].
Mặt khác 5-(p-diethylaminobenzyliden)rhodanin còn ứng dụng vào việc tạo phức chelat với platin (Pt), paladi (Pd)… trong phương pháp định lượng bằng HPLC.
Tương tự cũng có thể dùng loại thuốc thử trên để định lượng bạc (Ag), có thể xác định hàm lượng bạc tối thiểu trong khoảng 0,05–0,1 ppm/10ml mẫu [90].
Rhodanin và các dẫn chất còn dùng làm chỉ thị trong định tính và định lượng nhiều hợp chất như cyanid, tannase, quinon [93], [102].
Cho acid 1,2-naphthoquinon-4-sulfonic ngưng tụ vào carbon ái nhân ở vị trí số 5 của vòng rhodanin, sản phẩm sẽ tạo kết tủa đỏ trong dung dịch acid và chuyển sang màu tím xanh trong dung dịch kiềm, chất này khá nhạy khi dùng phát hiện một số chất có tính acid hoặc kiềm [36].
1.8.2. Ứng dụng trong phim ảnh
Một trong những ứng dụng quan trọng của các 4-thiazolidinon là tạo ra thuốc nhuộm merocyamin cần thiết cho kỹ thuật ảnh. Thuốc nhuộm merocyamin rất nhạy cảm với nhũ dịch bạc halid.
Thuốc nhuộm merocyamin
Các dẫn chất của rhodanin có tác động chống lại các vết mờ trên ảnh. Chúng làm giảm tác dụng khử của bạc halid bằng cách tạo tủa của muối bạc hoặc tạo các phức chelat nên giảm sự tiếp xúc của bạc lên film.
Các dẫn chất thế phenyl, benzyl, cyclohexyl và nhóm alkyl có chuỗi carbon trong khoảng 6–10 carbon trên vị trí số 3 của 5-aryliden-2-phenylimino-4- thiazolidinon có khả năng bảo vệ phim ảnh nhạy sáng khỏi tác động của tia UV [36].
1.8.3. Ứng dụng trong y học
1.8.3.1. Tác dụng kháng vi khuẩn, vi nấm và Mycobacteria
Thực nghiệm cho thấy các dẫn chất aryliden của 3-aminorhodanin có tác dụng ức chế vi khuẩn lao trên invitro, đặc biệt dẫn chất 3-amino-5-(4-hydroxy-3- methoxybenzyliden)rhodanin có hoạt tính khá tốt.
3-amino-5-(4-hydroxy-3- methoxybenzyliden)rhodanin
Bên cạnh đó, các hợp chất 3,5-dimethyl và 3-ethyl-5-methylrhodanin cũng cho thấy có tác động ức chế vi khuẩn lao [50], [97].
Acid actithiazic là một chất được chiết ra từ các chủng Streptomyces có tác dụng đối kháng mạnh với vi khuẩn lao trên in vitro [36].
Acid actithiazic
Các dẫn chất của thiazolidin – nhất là các dẫn chất aryliden, alkyliden, hydrazon v.v… có tác dụng tốt trong việc ngăn chặn sự phát triển của nhiều chủng vi khuẩn, vi nấm bao gồm cả Staphylococcus epidermidis, Candida albicans,
Aspergilus niger… [26], [36], [40], [55], [62], [64], [65], [70], [77], [96], [103].
1.8.3.2. Tác dụng kháng ung thư
Theo Gududura và cộng sự một số amid của acid 2-arylthiazolidin-4-carboxylic có tác dụng làm giảm sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tiền liệt [56].
Một vài dẫn chất của rhodanin có khả năng ức chế sự phát triển khối u trên chuột thí nghiệm. Trong số các chất được nghiên cứu có 4 chất thuộc dẫn chất (Z)-2- (5-((5-(4-clorophenyl)furan-3-yl)methylen)-4-oxo-2-thioxothiazolidin-3-yl)-N-
alkylacetamid được đề nghị phát triển thành thuốc chống ung thư do khả năng ức chế sự phát triển khối u khá tốt [22], [39].
Dẫn chất (Z)-2-(5-((5-(4-clorophenyl)furan-3-yl)methylen)-4-oxo-2- thioxothiazolidin-3-yl)-N-alkylacetamid
1.8.3.3. Các tác dụng khác
Một số dẫn chất 5-furylidenrhodanin có tác dụng hạn chế độc tố của vi khuẩn cũng như ức chế sự phát triển của mầm bào từ bệnh than trên in vivo [64].
Dẫn chất 5-furylidenrhodanin
Năm 2007, Kumar và cộng sự nghiên cứu tác dụng ức chế sự phát triển của
Plasmodium falciparum của các dẫn chất 5-arylidenrhodanin và nhận thấy nhiều
chất cho tác dụng tốt trên in vitro đặc biệt là chất 3-phenyl-5-(2,5- dihydroxybenzyliden)rhodanin có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của
Plasmodium falciparum [69].
Ngăn ngừa các trường hợp thiếu máu cục bộ gây tổn thương đến các tế bào thần kinh, điều trị viêm khớp, viêm ruột, phì đại cơ: các dẫn chất thế benzyl-, hoặc arylrhodanin [81], [91].
Nhóm dẫn chất 5-benzylidenrhodanin còn thể hiện tính ức chế PDE4 có tác dụng kháng viêm, giảm tác nhân gây ức chế hô hấp trong bệnh hen suyễn hoặc tắc nghẽn phổi mãn tính. Theo kết quả nghiên cứu của Irvine và các cộng sự hai chất
(E)-5-(3-(cyclopentyloxy-4-methoxybenzyliden)rhodanin và (E)-3-ethyl-5-(4-
hydroxy-3-methoxybenzyliden)rhodanin ức chế PDE4 mạnh [60].
(E)-5-(3-(cyclopentyloxy-4-methoxybenzyliden)rhodanin
(E)-3-ethyl-5-(4-hydroxy-3-methoxybenzyliden)rhodanin
Nghiên cứu của Kikkawa và các cộng sự cho thấy chất 3-carboxymethyl-5-[(2E)- methyl-3-phenylpropenyliden]rhodanin có tác dụng hạ đường huyết do rối loạn thần kinh ngoại biên trên chuột thực nghiệm [68], [75].
3-carboxymethyl-5-[(2E)-methyl-3-phenylpropenyliden]rhodanin
Nhóm các dẫn chất 5-benzylidenrhodanin đặc biệt là chất 5-[5-bromo-2-(2- bromophenoxy)benzyliden]rhodanin có tác dụng ức chế in vitro một số loại enzym được cho là tác nhân gây ra các loại ung thư như PRL-3 [23].
5-[5-bromo-2-(2-bromophenoxy)benzyliden]rhodanin
Các chất N-trypthophyl-5(4-clorobenzyliden)-2,4-thiazolidindion và N-
trypthophyl-5-(4-clorobenzyliden)rhodanin có tác dụng chống phù nề ở liều 50 mg/kg thể trọng tương đương với tác dụng của indomethacin ở liều 10 mg/kg
thể trọng [51].
N-trypthophyl-5-(4-clorobenzyliden)-2,4-thiazolidindion
N-trypthophyl-5(4-clorobenzyliden)rhodanin
Ngoài tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, vi nấm, trong các nghiên cứu mới đây cho thấy một số dẫn chất của thiazolidin như 2,3-diaryl-1,3-thiazolidin-4- on có nhiều khả năng ức chế các loại virus như virus HIV, HCV, Enchovirus 12 … [29, [46],[88], [95].
2,3-diaryl-1,3-thiazolidin-4-on
CFTR là một protein gây ra sự tăng tiết dịch trong ruột cũng như ở đường tiêu hóa. Các nghiên cứu chỉ ra rằng nếu ức chế hoạt tính CFTR sẽ làm giảm tiêu chảy và giảm tỷ lệ tử vong do tiêu chảy. Với việc nghiên cứu các dẫn chất 2- thioxo-4-thiazolidinon, Tonghui Ma và các cộâng sự đã tìm ra sáu dẫn chất 5- carboxybenzyliden-2-thioxo-3-[trifluoromethylphenyl]-4-thiazolidinon có tính ức chế CFTR, các chất này làm giảm sự tiết dịch ở ruột gây ra bởi độc tố của Vibrio
cholerae gây nhiễm trên chuột và do đó giảm triệu chứng tiêu chảy [74].
Năm 2005, Gursoy và Terzioglu nhận thấy một số dẫn chất 2-arylimino-3- (ethyl-4(H)-quinazolinon-2-ylmercaptoacetylamino)-5-methylthiazolidin-4-on có tác dụng chống động kinh trên chuột thí nghiệm [57].
2-arylimino-3-(ethyl-4(H)-quinazolinon-2-ylmercaptoacetylamino)-5- methylthiazolidin-4-on
1.8.4. Các ứng dụng khác
3-aminorhodanin và một vài dẫn chất như N-acetylaminorhodanin và N- benzoylaminorhodanin còn được dùng trong nông nghiệp như các loại thuốc trừ sâu, diệt ký sinh trùng, tuyến trùng cho cây. Theo Inamori và cộng sự, 3-amino rhodanin thể hiện tính diệt côn trùng cao có thể do nhóm amin tự do ở vị trí số 3 của vòng thiazolidin là tác nhân làm tăng hoạt tính của 3-aminorhodanin [59].
N-acetylaminorhodanin N-benzoylaminorhodanin
Bên cạnh đó một số dẫn chất rhodanin còn được sử dụng trong quá trình lưu hóa cao su [36].
CHƯƠNG 2.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. 1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Trong khuôn khổ luận án này chúng tôi tập trung nghiên cứu các dẫn chất 3-salicylamidothiazolidin bao gồm: Các dẫn chất 3-(5-halogeno / nitrosalicylamido)rhodanin: - 3-salicylamidorhodanin và các dẫn chất 5-aryliden-3-salicylamido- rhodanin. - 3-(5-clorosalicylamido)rhodanin và các 5-aryliden-3-(5-clorosalicyl-amido) rhodanin. - 3-(5-bromosalicylamido)rhodanin, các 5-aryliden-3-(5-bromosalicyl-amido rhodanin. - 3-(5-iodosalicylamido)rhodanin, các 5-aryliden-3-(5-iodosalicylamido)- rhodanin. - 3-(5-nitrosalicylamido)rhodanin và các 5-aryliden-3-(5-nitrosalicyl-amido) rhodanin. Các dẫn chất 3-salicylamidothiazolidin-2,4-dion: - 3-salicylamidothiazolidin-2,4-dion và các 5-aryliden-3-salicylamido- thiazolidin-2,4-dion. Các dẫn chất 3-salicylamidothiorhodanin: - 3-salicylamidothiorhodanin. - 3-(5-clorosalicylamido)thiorhodanin. - 3-(5-nitrosalicylamido)thiorhodanin. - 3-(5-bromosalicylamido)thiorhodanin. - 3-(5-iodosalicylamido)thiorhodanin.
2. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 2.2.1. Các hóa chất cơ bản dùng trong nghiên cứu 2.2.1. Các hóa chất cơ bản dùng trong nghiên cứu
Các hóa chất dùng cho phản ứng tổng hợp có nguồn gốc từ các nhà phân phối Acros, Merck và Trung Quốc .
Bảng 2.1: Các nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Hàm lượng (%)
1 Acid 5-bromosalicylic Acros – Bỉ 98
2 Acid 5-clorosalicylic Acros – Bỉ 98
3 Acid 5-iodosalicylic Acros – Bỉ 97
4 Acid 5-nitrosalicylic Acros – Bỉ 99
5 2-clorobenzaldehyd Acros – Bỉ 99 6 4-clorobenzaldehyd Acros – Bỉ 98,5 7 2,4-diclorobenzaldehyd Acros – Bỉ 98 8 4-fluorobenzaldehyd Acros – Bỉ > 98 9 2-furaldehyd Acros – Bỉ 99 10 4-N,N-dimethylaminobenzaldehyd Acros – Bỉ > 99 11 2-nitrobenzaldehyd Merck – Đức 99 12 3-nitrobenzaldehyd Merck – Đức 98 13 4-nitrobenzaldehyd Merck – Đức 98 14 4-methoxybenzaldehyd Merck – Đức 97 15 2,3-dimethoxybenzaldehyd Merck – Đức 97 16 3,4-dimethoxybenzaldehyd Merck – Đức 98 17 3,4,5-trimethoxybenzaldehyd Merck – Đức 98 18 3-hydroxy-4-methoxybenzaldehyd Merck – Đức 99
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Hàm lượng (%)
20 Phosphorus pentasulfid Merck – Đức 27,8 – 28,9
21 Bản mỏng Silicagel 60 F254 Merck – Đức
22 Acid acetic băng Trung Quốc 99
23 Acid sulfuric Trung Quốc 95 – 98
24 Acid hydrocloric Trung Quốc 34 – 36
25 Carbondisulfid Trung Quốc 97
26 Dioxan Trung Quốc 98,5
27 Hydrazin hydrat Trung Quốc 64
28 Methanol Trung Quốc 99,5
Các hóa chất dùng cho sắc ký lớp mỏng, xác định cấu trúc và các thông số đặc trưng là các loại hóa chất tinh khiết dành cho phân tích của các hãng Merck, Prolabo… bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 của Merck.
2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị
Các dụng cụ thủy tinh dùng trong tổng hợp hóa học.
Các máy dùng cho việc xác định cấu trúc và các thông số đặc trưng cho sản phẩm:
Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt của Trung Quốc Máy đo nhiệt độ nóng chảy: SMP3.
Máy đo quang phổ UV - Vis: UV-2010 Spectrophotometer / HITACHI. UV-3200 Spectrophotometer / LABOMET Máy đo quang phổ hồng ngoại: IR FTIR 8101 / SHIMADZU
IR FTIR Alpha / BRUKER. Máy đo phổ cộng hưởng từ: BRUKER AV 500MHz.
2. 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.3.1. Tổng hợp 2.3.1. Tổng hợp
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ quy trình tổng hợp các dẫn chất 3-salicylamidothiazolidin