3.3.1. Đặc điểm hình thái
Chúng tôi tiến hành cấy dàn chủng CT3 và CT7 lên bề mặt thạch đĩa có MT1 ở 37oC. Sau 24 giờ quan sát hình dạng, màu sắc, bề mặt KL. Làm tiêu bản nhuộm Gram theo phương pháp 2.3.3.2 và nhuộm bào tử theo phương pháp 2.3.3.3. Kết quả được nêu trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái của hai chủng CT3 và CT7 Đặc điểm hình thái chủng CT3 Đặc điểm hình thái chủng CT7
- KL: bề mặt hơi nhăn, màu trắng đục, mép nhăn, lan trên bờ mặt thạch
- Tế bào: hình que, ngắn, nhỏ, xếp đơn hoặc đôi, bắt màu tím, điều này chứng tỏ chủng này là VK Gram dương
- Hình thành nội bào tử, phân bố chính tâm.
- KL: bề mặt mịn, màu trắng đục, mép hơi gợn sóng, bám chặt vào MT thạch.
- Tế bào hình que, nhỏ, xếp đơn, bắt màu tím, điều này chứng tỏ chủng này là VK Gram dương.
- Hình thành nội bào tử, phân bố chính tâm.
Hình 3.3. Hình thái tế bào của chủng CT3 và chủng CT7 (x100) Hình 3.4. Bào tử của chủng CT3 và chủng CT7 (x100) Chủng CT3 Chủng CT7 Hình 3.2. Hình thái KL của chủng CT3 và chủng CT7 (x4) CT7 Chủng CT7 Chủng CT3 Chủng CT3 Chủng CT7
3.3.2. Xác định khả năng sinh enzyme catalase
Tiến hành nuôi cấy chủng CT3 và CT7 trên bề mặt thạch môi trường MT1 ở nhiệt độ 370C. Sau 24 giờ khi xuất hiện KL, nhỏ lên KL 1 giọt H2O2 10% thì thấy xuất hiện bọt khí. Chứng tỏ cả 2 chủng đều có khả năng sinh enzyme catalase :
H2O2 H2O + O2
Chính khí O2 bay lên làm xuất hiện bọt khí. Qua đó chứng tỏ cả 2 chủng là VSV hiếu khí.
3.3.3. Sơ bộ định danh
Các kết quả thu nhận được khi nghiên cứu các đặc điểm sinh học của 2 chủng nghiên cứu được trình bày tóm tắt ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Tóm tắt một số đặc điểm sinh học của chủng CT3 và chủng CT7
Đặc điểm sinh học Chủng CT3 Chủng CT7
Gram (+) + +
Hình thành nội bào tử + + Nhu cầu về oxy + +
Catalase + +
Ghi chú: +: kết quả dương tính - : kết quả âm tính
Theo khóa phân loại của Bergey (2004) và kết quả khảo sát đặc tính sinh học của 2 chủng khảo sát được trình bày ở bảng 3.3, bảng 3.4, cho phép chúng tôi kết luận như sau: Chủng CT3 và chủng CT7 thuộc chi Bacillus.
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT lên khả năng sinh tổng hợp protease của hai chủng Bacillus
Các điều kiện nuôi cấy như thành phần MT, pH, nhiệt độ nuôi cấy,… có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng cũng như khả năng sinh tổng hợp enzyme của VSV. Do đó, khi nghiên cứu khả năng sinh protease của VK, việc khảo sát tìm ra các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp protease là điều cần thiết.
3.4.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của MT lên khả năng sinh tổng hợp protease của 2 chủng Bacillus: CT3, CT7, chúng tôi nuôi 2 chủng Bacillus: CT3, CT7 trên các MT khác nhau (MT3 đến MT7 như đã trình bày trong phần 2.2) theo phương pháp 2.3.6. Sau 48h, thu dịch enzyme thô (mục 2.3.7), xác định hoạt độ protease của 2 chủng theo phương pháp Anson cải tiến (mục 2.3.9). Kết quả được trình bày tại bảng 3.5 và biểu đồ 3.2.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến hoạt độ protease của 2
chủng Bacillus
STT Môi trường Hoạt độ protease (UI/ml)
Chủng CT3 Chủng CT7 1 MT3 1,652 ± 0,01 1,543 ± 0.016 2 MT4 1,395 ± 0,015 1,442 ± 0.019 3 MT5 1.914 ± 0.017 1,789 ± 0.004 4 MT6 1,834 ± 0.004 1,73 ± 0.006 5 MT7 1,452 ± 0.041 1,331 ± 0.013
Chúng tôi nhận thấy cả 2 chủng CT3 và CT7 có hoạt độ cao nhất khi nuôi cấy trong MT5. Điều này có thể giải thích là do trong thành phần của MT5 có casein, casein đóng vai trò là chất cảm ứng sinh enzyme protease. Hơn nữa so với các MT khác, MT5 có thêm các loại khoáng là canxi (CaCl2), kẽm (ZnSO4), sắt (FeSO4.7H2O), đồng (CuSO4. 5H2O). Theo N.S. Egorov (1985), canxi có vai trò điều chỉnh pH môi trường, canxi có ảnh hưởng quan trọng đến dinh dưỡng nitơ, carbohydrate, và dinh dưỡng phospho của VSV, Zn2+tạo điều kiện thuận lợi để cắt đứt liên kết peptid. Ngoài ra các ion trên còn duy trì cấu trúc hoạt động của enzyme ở nhiệt độ cao (Kumar và Takagi, 1999).
Kết quả này cũng thống nhất với kết quả nghiên cứu của tác giả Lê Uyển Thanh (2009) khi nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp protease từ các chủng
Bacillus phân lập từ ao cá tra.
3.4.2. Ảnh hưởng của loại cơ chất cảm ứng
3.4.2.1. Xác định hàm lượng nitơ tổng số của các chất cảm ứng
Để tìm ra nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease của 2 chủng nghiên cứu, trước hết chúng tôi xác định hàm lượng nitơ tổng số, từ đó điều chỉnh lượng bổ sung các chất vào MT sao cho hợp lí. Tiến hành xác định hàm lượng nitơ theo phương pháp Kjeldahl trình bày ở mục 2.3.14. Kết quả trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Hàm lượng nitơ tổng số của các nguyên liệu STT Nguyên liệu Nitơ tổng (%) Protein (% )
1 Bột đậu nành 6,37 41,41 2 Casein 13,93 90,54 3 Pepton 14,55 94,60
3.4.2.2. Ảnh hưởng của loại cơ chất cảm ứng
Để lựa chọn nguồn cơ chất thay thế thích hợp chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng CT3, CT7 trên MT5 với cơ chất cảm ứng khác nhau: 1% casein, 1% pepton, 2% bột đậu nành. Đối chứng là nuôi 2 chủng trên MT5 không bổ sung cơ chất. Sau
48h, thu dịch enzyme thô, xác định hoạt độ protease của 2 chủng theo phương pháp Anson cải tiến. Kết quả được trình bày tại bảng 3.7 và biểu đồ 3.3.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng loại cơ cất cảm ứng đến hoạt độ protease của
2 chủng Bacillus
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng loại cơ cất cảm ứng đến hoạt độ protease
của 2 chủng Bacillus
Từ kết quả trên cho thấy trong MT5 không có bổ sung cơ chất, 2 chủng
Bacillus vẫn có khả năng sinh tổng hợp protease vì trong thành phần của MT5 có peptone và cao thịt đóng vai trò là chất cảm ứng nhưng hoạt độ rất yếu.
STT Cơ chất Hoạt độ protease (UI/ml)
Chủng CT3 Chủng CT7
1 Đối chứng 0,776 ± 0,019 0,867 ± 0,004 2 Bột đậu nành 2,014 ± 0,013 1,781 ± 0,006
3 Pepton 1,454 ± 0,016 1,41 ± 0,01 4 Casein 1,957 ± 0,007 1,791 ± 0,007
Trong MT có bổ sung cơ chất protein hoạt độ tăng lên đáng kể. Trong 3 loại cơ chất cảm ứng pepton, casein, bột đậu nành thì casein và bột đậu nành cho hoạt độ protease cao ở cả hai chủng Bacillus.
Nguyên nhân bột đậu nành cho hoạt độ protease cao có thể liên quan đến thành phần của acid amin và các vitamin trong bột đậu nành có tác dụng kích thích quá trình sinh tổng hợp enzym. Bột đậu nành cũng là một trong những cơ chất giàu đạm, đóng vai trò là cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp protease [7].
Dù cả casein và bột đậu nành đều cho hoạt độ protease cao. Tuy nhiên, xét về tình hình kinh tế, bột đậu nành có giá thành rẻ hơn nhiều so với casein, nên chúng tôi chọn bột đậu nành làm cơ chất cảm ứng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng.
Đối với protease, bột đậu nành đóng vai trò là cơ chất cảm ứng. Nồng độ cơ chất cảm ứng cũng ảnh hưởng lớn tới hoạt độ protease. Vì thế, để lựa chọn nồng động chất cảm ứng thích hợp chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng CT3 và chủng CT7 trong MT có cơ chất cảm ứng là bột đậu nành với các nồng độ khác nhau: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5%, 3,0%. Sau 48h, thu dịch enzyme thô, xác định hoạt độ protease của 2 chủng theo phương pháp Anson cải tiến. Kết quả được trình bày tại bảng 3.8 và đồ thị 3.1.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng nồng độ bột đậu nành đến hoạt độ protease
của 2 chủng Bacillus
STT Nồng độ bột đậu nành (%)
Hoạt độ protease (UI/ml)
Chủng CT3 Chủng CT7 1 0,5 1,747 ± 0,007 1,412 ± 0,011 2 1,0 1,984 ± 0,017 1,560 ± 0,019 3 1,5 2,175 ± 0,013 1,643 ± 0,020 4 2,0 2,010 ± 0,022 1,721 ± 0,007 5 2,5 1,677 ± 0,029 1,919 ± 0,004 6 3,0 1,295 ± 0,013 1,516 ± 0.013
Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng nồng độ bột đậu nành đến hoạt độ protease của 2
chủng Bacillus
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt độ protease tăng tỉ lệ thuận với sự tăng tỉ lệ bột đậu nành cho tới giá trị cực đại rồi giảm xuống. Khi nồng độ cơ chất cảm ứng thấp, lượng enzyme protease tổng hợp thấp, trong trường hợp dư cơ chất dẫn đến ức chế phản ứng enzyme. Đối với chủng CT3 thì nồng bột đậu nành 1 – 2% hoạt tính protease rất mạnh, nhưng cực đại là ở 1,5% cho hoạt độ protease 2,175 (UI/ml). Chủng CT7 thì hoạt tính cao ở nồng bột đậu nành 1,5 – 2,5 %, nhưng cực đại là 2,5% cho hoạt độ protease 1,919 (UI/ml). Vậy nồng độ bột đậu nành thích hợp cho sinh tổng hợp protease ở chủng CT3 là 1,5%, chủng CT7 là 2,5%.
3.4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu
Hoat độ protease phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trường, vì pH môi trường ảnh hưởng đến mức ion hóa của cơ chất, trung tâm hoạt động của protease, phức chất protease – cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của protease. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ của protease.
Nuôi chủng CT3 trong MT5 có nồng độ bột đậu nành 1,5% và chủng CT7 trong MT5 có nồng độ bột đậu nành 2,5% , với pH ban đầu của môi trường thay đổi từ 5,5 đến 8,5. Sau 48h thu dịch enzyme thô, xác định hoạt độ protease của 2
chủng theo phương pháp Anson cải tiến. Kết quả được trình bày tại bảng 3.9 và đồ thị 3.2.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt độ protease của 2
chủng Bacillus
STT pH Hoạt độ protease (UI/ml)
Chủng CT3 Chủng CT7 1 5,5 1,259 ± 0,011 1,408 ± 0,018 2 6,0 1,641 ± 0,025 1,601 ± 0,020 3 6,5 2,152 ± 0,010 1,942 ± 0,004 4 7,0 2,417 ± 0,013 1,832 ± 0,011 5 7,5 2,353 ± 0,017 1,857 ± 0,011 6 8,0 2,027 ± 0,022 1,567 ± 0,004 7 8,5 1,728 ± 0,010 0,801 ± 0,022
Kết quả trên cho thấy trị số pH đầu tiên của MT ảnh hưởng không nhỏ tới sự sinh tổng hợp protease của 2 chủng nghiên cứu. Với pH ban đầu là 5,5 thì hoạt độ protease của chủng CT3 (1,259 UI/ml) thấp hơn hoạt độ protease của chủng CT7 (1,408 UI/ml). Với pH 8,5 hoạt độ protease chủng CT3 giảm mạnh chỉ còn 0,801
Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt độ protease của 2
(UI/ml) trong khi chủng CT3 có hoạt độ là 1,728 (UI/ml). Nguyên nhân là khi pH quá cao hoặc quá thấp sẽ làm ức chế quá trình trao đổi chất, ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và khả năng hoạt hóa enzyme của VK. Sự ảnh hưởng khác nhau tùy vào đặc tính sinh lý, sinh hóa của mỗi chủng. pH tối ưu là 7 với chủng CT3 cho hoạt độ cao nhất 2,417 (UI/ml) và pH tối ưu là 6,5 với chủng CT7 cho hoạt độ cao nhất 1,942 (UI/ml).
Nhiều nghiên cứu cho thấy pH thích hợp để nuôi cấy VK thu protease là 6,6 – 7,4 [19]. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Trần Thụy (2009) trên chủng B. subtilisphân lập từ đất vườn.
3.4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme của VSV. Nhiều nghiên cứu cho thấy nhờ khả năng sinh bào tử mà các VK Bacillus có khả năng sinh trưởng trong giới hạn nhiệt khá rộng, hầu hết các VK nhóm này đều là loài ưu ấm với nhiệt độ 200
C – 450C [28]. Nhằm tìm nhiệt độ tối ưu cho sự sinh tổng hợp protease của hai chủng Bacillus nghiên cứu chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ như sau:
Nuôi chủng CT3 trong MT5, nồng độ bột đậu nành 1,5%, pH của MT là 7. Nuôi chủng CT7 trong MT5, nồng độ bột đậu nành 2,5%, pH của MT 6,5. Cả hai chủng Bacillus này được nuôi ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 250C, 300C, 350C, 400C, 450C. Sau 48h thu dịch enzyme thô, xác định hoạt độ protease của 2 chủng theo phương pháp Anson cải tiến. Kết quả được trình bày tại bảng 3.10 và đồ thị 3.3.
Kết quả được trình bày trong bảng 3.10 và đồ thị 3.3 cho thấy hai chủng
Bacillus có khả năng sinh tổng hợp protase ở tất cả các điều kiện nhiệt độ nghiên cứu. Trong đó, hai chủng này cho hoạt độ cao trong khoảng nhiệt độ từ 30 - 45o
C, đạt tối đa ở nhiệt độ nuôi cấy 300C đối chủng CT3 và 350C đối với chủng CT7. Ở nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao, khả năng sinh protease của 2 chủng giảm vì các phản ứng sinh hóa bị ức chế.
Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của tác giả Puri S (2002), nhiệt độ thích hợp cho Bacillus sinh tổng hợp protease là 30 – 370C. Ở một số nghiên cứu khác của tác giả Al – Saleh (2007) và Shumi (2004) thì nhiệt độ tối thích cho VK sinh protease là 370C.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease của 2
chủng Bacillus
STT Nhiệt độ (0C)
Hoạt độ protease (UI/ml)
Chủng CT3 Chủng CT7 1 25 1,783 ± 0,007 1,429 ± 0,018 2 30 2,436 ± 0,006 1,946 ± 0,019 3 35 2,226 ± 0,011 2,023 ± 0,017 4 40 2,146 ± 0,018 1,828 ± 0,004 5 45 1,842 ± 0,015 1,681 ± 0,020
Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease
3.4.6. Ảnh hưởng của tốc độ lắc
Các chủng thuộc chi Bacillus đều là VSV hiếu khí. VSV khác nhau thì có nhu cầu về oxy khác nhau. Đặc biệt O2 tham gia vào phản ứng oxy hóa để cung cấp năng lượng cho hoạt động tế bào. Sự thay đổi chế độ lắc có ảnh hưởng tới mức độ pha trộn oxi cũng như các thành phần dinh dưỡng có trong MT [96]. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của chế độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng CT3 và chủng CT7.
Nuôi chủng CT3 trong MT5, nồng độ bột đậu nành 1,5%, pH của MT là 7, ở 300C. Nuôi chủng CT7 trong MT5 nồng độ bột đậu nành 2,5%, pH của MT 6,5 ở 350C. Cả hai chủng Bacillus này được nuôi ở các tốc độ lắc khác nhau: 110, 130, 150 và 180 vòng/phút. Sau 48h thu dịch enzyme thô, xác định hoạt độ protease của 2 chủng theo phương pháp Anson cải tiến. Kết quả được trình bày tại bảng 3.11 và đồ thị 3.4.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng chế độ lắc đến hoạt độ protease
của 2 chủng Bacillus
STT Tốc độ lắc (vòng/phút)
Hoạt độ protease (UI/ml)
Chủng CT3 Chủng CT7 1 110 1,989 ± 0,031 1,690 ± 0,026 2 130 2,171 ± 0,018 1,813 ± 0,006 3 150 2,421 ± 0,022 2,040 ± 0,024 4 180 2,205 ± 0,013 2,035 ± 0,019 5 200 2,112 ± 0,006 1,842 ± 0,018
Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng tốc độ lắc đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus
Kết quả được trình bày trong bảng 3.11 và đồ thị 3.4 cho thấy hai chủng
Bacillusđều có khả năng sinh tổng hợp protease ở các tốc độ lắc khác nhau. Tốc độ lắc từ 110 – 130 vòng/phút ảnh hưởng đáng kể đến hoạt độ protease, lúc này có thể do không đủ độ thông khí cũng như hấp thụ dinh dưỡng của hai chủng Bacillus
nghiên cứu, làm giảm tốc độ sinh trưởng nên hoạt độ protease giảm. Ở tốc độ lắc 180 -200 vòng/phút hoạt độ protease giảm có thể do tốc độ lắc cao làm biến tính enzyme, hoặc gây tổn hại các tế bào VK, khi số lượng VK giảm thì lượng protease được tổng hợp giảm. Tốc độ lắc 150 vòng/ phút cho hoạt độ protease cao nhất ở chủng CT3 là 2,421 UI/ml và chủng CT7 là 2,040 UI/ml.
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của tác giả Abbas Akhavan, Leila Jabalameli (2011) về protease của các chủng Bacillusphân lập từ đất.
3.4.7. Động học quá trình lên men
Nuôi cấy 2 chủng với tất cả các điều kiện tối ưu chúng tôi vừa khảo sát cho mỗi chủng. Sau mỗi 6 giờ đo pH môi trường nuôi cấy, OD620nm và thu dịch enzyme