và ngoài nước
Năm 1970, Kerry T. Yasunobu và James Mc Conn đã nghiên cứu tách chiết protease trung tính từ MT nuôi B. subtilis theo phương pháp nuôi bán rắn và nhận thấy protease này là một protease kim loại có ion Ca2+ trong trung tâm hoạt động, có pHopt từ 6,5-7,5, topt là 570C. Protease này bị ức chế bởi Cu2+
, Ni2+, Hg2+, Pb2+, Cd2+, Fe2+ và khi có mặt của ion Ca2+ enzyme này có thể bền trong khoảng pH từ 5,5-10 [59].
Dong Ho Ahn, Hoon Kim và Pack My (1993) đã nghiên cứu về protease tách từ B. megaterimATCC 14945 và nhận thấy enzyme này có thể bị kết tủa bằng ammonium sulphate, có pH thích hợp 7,5, nhiệt độ thích hợp 550C. Protease này cần có ion Ca2+và bị ức chế mạnh bởi EDTA [44].
Gonchar Am và Auslender VI (1996) đã tiến hành nghiên cứu cố định các protease của VK B. subtilis trên 1,4 – polyalkylene oxid bằng phương pháp chiếu chùm tia electron và chỉ ra rằng protease cố định bền với nhiệt hơn các protease dạng tự nhiên. Các protease cố định khi không có cơ chất có thể chịu được nhiệt độ 600C và nếu có cơ chất thì có thể chịu được nhiệt độ lên tới 800
C. Ngoài ra, protease cố định có khoảng pH hoạt động rộng hơn protease ở dạng không cố định [52].
Bên cạnh đó còn có rất nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm protease từ các loài Bacillus như: B. cereus (Sirecka et al., 1998), B. sphaericus (Singh et al., 1999), B. stearothermophilus (Kim et al., 2002), B. subtilis (Yang.et al., 2000), B. mojavensis (Beg và Gypta et al., 2003), B. lichieniformis (Mancrzinger et al., 2003, Sareen et al., 2005).
Alkaline protease lên men từ Bacillus sp. JP395 do Kitano và cộng sự nghiên cứu. Protease kiềm này có phân tử lượng khoảng 30KD, pH hoạt động trong khoảng 9 – 11, chịu nhiệt trong khoảng 50 – 650C, điểm đẳng nhiệt 9.5, bị kìm
hãm bởi PMSF, nhưng không bị kìm hãm bởi EDTA. Hoạt tính của chúng ổn định ở 400C trong thời gian 60 phút, ứng dụng chủ yếu trong công nghiệp giặt tẩy [89].
Alkaline protease lên men từ Bacillus sp. PD498 do Outtrup và cộng sự nghiên cứu. Enzyme này có khối lượng phân tử 34KD, pHopt từ 9 – 1, chịu nhiệt độ từ 40 – 550
C, được ứng dụng trong công nghệ giặt tẩy và chất hoạt động bề mặt [7]. Alkaline protease được chiết tách từ VK B. gibsonii (DSM 14393) do Weber, Angrit và cộng sự nghiên cứu. Đề tài đề cập đến phương pháp nâng cao hoạt tính protease kiềm trong lĩnh vực công nghiệp giặt tẩy [19], [89].
Protease alkaline variants do Kottwitz, Beatrix và cộng sự nghiên cứu cho biết protease kiềm này được chiết tách từ thể đột biến B. lentus, vị trí các amino acid đột biến là 61, 199, 211,... làm tăng độ phong phú của công nghệ sản xuất enzyme từ VSV [89].
Ở Việt Nam, cũng có nhiều công trình nghiên cứu về protease của Bacillus, các công trình công bố tập trung trên các lĩnh vực tách chiết, tinh chế, nghiên cứu một số đặc tính của protease. Một số công trình nghiên cứu như:
Năm 1983, Phạm Thị Trân Châu công bố các nghiên cứu về protease của B. pumillus [1], [4] và cho thấy từ MT nuôi cấy B. pumillus có thể thu được hai loại protease: một protease kiềm điển hình hoạt động ở pH 10,7 và một protease trung tính nhạy cảm cới DFP gọi là serine – matalo – proteinase hoạt động ở pH 7,0.
Ngô Thị Mai, Nguyễn Thị Dự và cộng sự (1991) đã dùng protease B. subtilis để thủy phân cá. Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi sử dụng 0,3% chế phẩm protease B.subtilis, trong điều kiện 500C thì thời gian chế biến nước mắm rút ngắn còn 10 ngày và 30 - 45 ngày trong điều kiện tự nhiên của mùa hè.
Những nghiên cứu trong nước gần đây từ proteasecủa Bacillus sp:
Vũ Ngọc Bội (2004), CPE thu nhận từ B. subtilis S5 có hoạt tính 33UI/g, dùng trong chế biến nước mắm.
Âu Thị Bích Phượng (2006), thu nhận protease từ Bacillus sp. có hoạt tính đạt 1,7 UI/g.
Lê Văn Việt (2007), thu nhận protease từ canh trường nuôi cấy bán rắn
Bacillus sp. có hoạt tính 30,9 (UI/g) được đề nghị sử dụng làm probiotic cho chăn nuôi.
Đỗ Trần Ngoan (2007) đã nghiên cứu tổng hợp protease kiềm tính bằng
phương pháp lên men bởi tế bào VK B. subtiliscố định.
Trần Ngọc Hùng (2010), nghiên cứu chế phẩm protease từ B. subtilis để sử dụng trong chế biến thức ăn gia cầm đã thu nhận protease có hoạt tính đạt 14 (UI/g) chế phẩm.
Trần Thị Hồng Nghi, Lê Thanh Hùng, Trương Quang Bình (2009), nghiên cứu ứng dụng enzyme protease từ VK (B. subtilis) để thủy phân phụ phẩm cá tra.
Nguyễn Hiền Trang, Đỗ Thị Bích Thủy (2006), tuyển chọn và nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease ngoại bào của
B. amyloliquefaciens T9.
Đỗ Thị Bích Thủy (2006), nghiên cứu nuôi cấy trực tiếp VK B. subtilis để loại bỏ protein ra khỏi phần vỏ phế liệu tôm.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP