1.3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng
Số loại và tỷ lệ các thành phần dinh dưỡng của MT có ý nghĩa quyết định đến khả năng sinh tổng hợp protease ở VSV nói chung, VK Bacillus nói riêng. Để tăng lượng protease trong MT cần lựa chọn nguồn carbon, nguồn nitrogen, muối khoáng thích hợp, chọn tỷ lệ thích hợp các thành phần này và đặc biệt là nguồn cơ chất cảm ứng.
Nguồn dinh dưỡng carbon
Nguồn carbon thường dùng để nuôi cấy VSV là các glucid: mono-, di- và polysaccharide (tinh bột). Tác dụng của nguồn carbon này tuỳ thuộc bản chất hoá học của chúng và đặc tính sinh lý của VSV. Nồng độ glucid thích hợp nhất cho quá trình sinh tổng hợp protease cũng thay đổi tuỳ loài VSV. Nguồn carbon tự nhiên thường dùng trong nuôi cấy là bột mì, bột gạo, các loại cám hoặc nước chiết của những nguyên liệu này[15].
Tinh bột là nguồn carbon của nhiều chủng VK sinh tổng hợp enzyme protease. Ví dụ: VK B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở MT tinh bột > 8%.
Theo Ostroko và cộng sự (1977), glucose, saccharose, maltose, fructose và sorbitol là nguồn carbon tốt nhất cho sự tổng hợp protease ở VK B. subtilis [15].
Nguồn dinh dưỡng nitơ
Nguồn nitơ trong MT nuôi cấy VSV có thể là các chất hữu cơ (protein và các sản phẩm thuỷ phân của protein) hoặc các muối vô cơ chứa nitơ (amoni, nitrat). Giá trị dinh dưỡng của các nguồn nitơ khác nhau tuỳ thuộc vào khả năng thu nhận nitơ từ nguồn là NH3.
Nguồn nitơ hữu cơ thường ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease, vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này. Các nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là: pepton, casein, albumin, bột đậu tương...Trong số này, peptone ở nồng độ thấp thường là chất cảm ứng tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp protease. Thay thế peptone bằng casein sẽ làm giảm rõ rệt lượng protease được tổng hợp nhất là khi casein ở nồng độ cao.
Nguồn nitơ vô cơ tốt nhất cho VK thường là (NH4)2SO4, các muối clorua, sulphate, nitrate amon thường có ảnh hưởng không tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease.
Khi sử dụng phối hợp nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng kể quá trình tổng hợp protease [12].
Các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng
Các hợp chất khoáng có ý nghĩa rất lớn trong quá trình nuôi cấy VSV vì chúng làm thay đổi trạng thái hoá keo của tế bào chất. Trong đó, phospho và lưu huỳnh có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình sinh tổng hợp protease. Các photphase vô cơ có ảnh hưởng không tốt đến sự sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, KH2PO4 thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp do tính chất đệm của nó. Lưu huỳnh có ảnh hưởng khác nhau lên quá trình sinh tổng hợp protease, nó có vai trò điều hòa quá trình tổng hợp protease của VSV [16].
Trong tế bào VSV người ta còn thấy sự có mặt của nhiều yếu tố khoáng như: magiê, natri, sắt,... Các VSV có thể lấy các chất khoáng này từ MT hay được bổ sung vào MT nuôi cấy một số dạng muối khoáng hoặc có sẵn trong nguyên liệu pha MT [28].
Cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp protease
Trong số các enzyme do VSV tổng hợp, một số enzyme trong điều kiện thường được tổng hợp với một lượng rất ít, nhưng hàm lượng của chúng có thể tăng gấp nhiều lần khi chúng ta cho thêm một số chất nhất định vào MT nuôi cấy. Monob và Cohn (1952) gọi các enzyme này là enzyme cảm ứng. Chất gây nên hiệu quả này là chất cảm ứng.
Chất cảm ứng là cơ chất đặc hiệu của enzyme hay những chất tương tự như cơ chất hoặc những sản phẩm trung gian của quá trình biến đổi các chất [42].
Khả năng sinh tổng hợp protease thường được cảm ứng bởi các chất giàu đạm như bột đậu nành, đậu phộng, bột cá, bột tôm, bột nghiền móng, sừng hoặc lông vũ... Tuy nhiên, đối với các loại cơ chất khác nhau thì hoạt độ enzyme cũng thể hiện không giống nhau. Do đó, trong MT nuôi cấy VSV ta có thể lựa chọn bổ sung các cơ chất thích hợp nhằm thu lượng lớn protease cần thiết một cách nhanh chóng và khoa học [7].
1.3.2.2. Ảnh hưởng của yếu tố MT lên khả năng sinh tổng hợp protease
Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme của VSV cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp. Tùy từng chủng VSV mà nhiệt độ thích hợp khác nhau.
NS thường phát triển ở khoảng nhiệt độ 22 – 320
C. Còn VK thì phát triển ở nhiệt độ cao hơn thường là 35 – 550C.
Đa số các VSV tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng khi ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp.
pH môi trường
Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH của MT thường ít làm ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở VSV vì MT bán rắn có tính đệm cao và hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của VSV. Đối với nấm sợi, pHopt
thích hợp cho quá trình tổng hợp protease vào khoảng 6 - 6,5. Các VK phát triển tốt và tạo nhiều enzyme ở pHopt trung tính 6,6 – 7,4 [15].
Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề sâu, pH có ảnh hưởng rất lớn đến sự tích lũy protease trong môi trường. pH của MT thay đổi sau khi thanh trùng MT và đặc biệt thay đổi rất lớn trong quá trình nuôi cấy, pH ban đầu thích hợp cho phát triển của NS 3,8 – 5,6, với VK 6,2 – 7,4. Trong quá trình nuôi cấy, tùy theo thành phần MT và các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất của VSV, mà pH của MT sẽ chuyển dần về phía axit hoặc kiềm.
Đối với các loài thuộc chi Bacillus, pH thường chuyển về kiềm. Người ta có thể căn cứ vào pH của MT sau khi nuôi cấy để dự đoán lượng protease tích lũy trong MT. Theo tác giả Lê Ngọc Tú và La Văn Chứ, pH của MT ảnh hưởng tới tỷ lệ giữa các protease được tổng hợp. Do đó, nếu giữ pH của MT ổn định trong suốt thời gian nuôi cấy, VSV sẽ tạo một loại protease xác định chiếm ưu thế trong MT. [30], [44].
Độ thông khí
Oxy rất cần đối với đời sống VSV hiếu khí. Tăng sự thông khí đến giới hạn xác định thì sự phát triển của VSV cũng tăng theo. Đối với nhiều VSV, thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm phát và nâng cao sinh khối. Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các VSV khác nhau. Trong một số trường hợp thiếu oxy tuy có kìm hãm sự phát triển của VSV nhưng lại tăng quá trình tổng hợp protease. Sự hiếu khí mạnh làm kìm hãm sự tổng hợp protease [16]. Ở MT bề mặt người ta thường thêm chất tạo xốp như trấu vào, còn ở MT bề sâu (MT dịch thể), thì người ta thường dùng thiết bị sục khí.
Độ ẩm
Độ ẩm MT là lượng nước có trong MT nuôi cấy. Nước đóng vai trò quan trọng trong mọi hoạt động sống VSV. Nước tham gia vào thành phần tế bào, tham gia các phản ứng sinh hóa trong quá trình trao đổi chất, là chất dung môi hòa tan chất dinh dưỡng ở VSV.
Độ ẩm là yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng của VSV khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt và phụ thuộc vào thành phần MT bề mặt. Độ ấm MT xốp thích hợp nuôi NS là 50 – 60%, còn đối với VK là 50 – 70% [28].
Thời gian nuôi cấy
Các chủng VSV khác nhau có tốc độ sinh trưởng khác nhau. Tốc độ sinh trưởng VSV thường liên quan đến thời gian nuôi cấy và là yếu tố có vai trò rất quan trọng trong việc sinh tổng hợp enzyme. Mặt khác, yếu tố thời gian còn quyết định năng suất của việc sản xuất chế phẩm enzyme. Thông thường, enzyme được tổng hợp nhiều nhất trong MT nuôi cấy tại một thời gian nhất định nào đó. Thời gian lên men còn phụ thuộc vào chủng VSV, thành phần MT, điều kiện nuôi cấy.
1.3.2.3. Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy
Để thu nhận chế phẩm protease từ VSV cũng như các enzyme khác có thể dùng hai phương pháp nuôi cấy: phương pháp nuôi cấy bề mặt (phương pháp nổi) và phương pháp bề sâu (phương pháp chìm) [16].
Nuôi cấy bề mặt
Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng sử dụng phương pháp nuôi cấy bề mặt kinh tế hơn. Chủng VSV có thể tạo ra một hệ enzyme ngoại bào đa dạng và sản phẩm không cần tinh sạch nên phương pháp nuôi cấy bề mặt được sử dụng nhiều trong sản xuất men tiêu hóa dùng trong chăn nuôi [80].
Nguyên liệu thường được dùng tạo ra MT bán rắn để nuôi cấy NS và một số VK thường là cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê. Để làm tăng độ xốp của MT bán rắn người ta thường bổ sung trấu hay lõi ngô đã được làm nhỏ (12 - 20%). Mặt khác, để tăng cường quá trình sinh tổng hợp enzyme cảm ứng người ta thường cho thêm vào MT những cơ chất có tính cảm ứng cho enzyme này.
pH trong phương pháp nuôi cấy bề mặt thay đổi theo chủng VSV: 5,6 – 6,2 đối với NS và 6,2 – 7,2 đối với VK ở nhiệt độ duy trì 28 - 300C, độ ẩm không khí 75 – 95% trong thời gian 36 - 72 giờ. Đối với mỗi chủng VSV, cần lựa chọn thời gian nuôi thích hợp mà lượng enzyme trong MT lớn nhất. Độ ẩm MT nên vào khoảng 58 – 60%.
Ưu điểm: nồng độ enzyem tạo thành ở MT bán rắn cao hơn nhiều so với dịch nuôi cấy theo phương pháp chìm sau khi đã tách tế bào VSV.
Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính của enzyme, chế phẩm khô, dễ dàng bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp trong điều kiện không cần enzyme tinh sạch.
Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt còn có một ưu điểm nữa là không cần thiết bị phức tạp. Nuôi cấy trong điều kiện không cần vô trùng tuyệt đối và nếu bị tạp nhiễm phần nào thì loại bỏ phần đó.
Nuôi cấy chìm
Hiệu suất lên men chìm dễ cơ khí hóa, tự động hóa, ít nhân công và có thể sản xuất liên tục là những ưu điểm lớn mà hiện nay nhiều sản xuất chọn phương pháp nuôi cấy chìm để sản xuất enzyme.
Trong phương pháp này, VSV phát triển trong MT lỏng có sục khí và khuấy đảo liên tục. Nguồn carbon trong phương pháp này thường là tinh bột, rỉ
đường,… Nguồn nitơ thường là cao ngô. Ngoài những nguồn cơ chất và khoáng như trong phương pháp nuôi cấy bề mặt, trong phương pháp nuôi cấy chìm, người ta còn bổ sung thêm các chất cảm ứng cho việc sinh tổng hợp enzyme. Các chất cảm ứng này có thể là cơ chất hoặc không phải là cơ chất của enzyme cần phản ứng.
Phương pháp nuôi cấy chìm đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng MT dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy nên không thích hợp với các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ. Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản, nên cấy trực tiếp VK vào thùng men (chứ không qua giai đoạn nuôi cấy trung gian) sẽ đảm bảo MT khỏi bị nhiễm.
Protease sản xuất trên MT khuấy trộn và MT rắn có pH và nhiệt độ hoạt động tối ưu tương tự nhau, tuy nhiên việc nuôi cấy trên MT rắn cho protease có độ bền với nhiệt độ và pH cao hơn so với nuôi cấy trên MT khuấy trộn [74].
1.3.3. Thu nhận và tinh sạch enzyme từ môi trường nuôi cấy
Tùy theo mục đích sử dụng mà cần các dạng chế phẩm enzyme khác nhau: một số ngành thực phẩm thì đòi hỏi phải sử dụng chế phẩm enzyme ở dạng sạch, trong dược phẩm thì đòi hỏi các chế phẩm enzyme phải cực kì tinh sạch và phải có hoạt lực đặc hiệu tuyệt đối. Trong một số trường hợp, MT nuôi cấy VSV có chứa enzyme được trực tiếp sử dụng dưới dạng thô, không cần tách tạp chất, ví dụ như trong công nghiệp rượu, công nghiệp thuộc da,... [21].
1.3.3.1. Thu dịch enzyme
Đối với enzyme ngoại bào người ta tách sinh khối và các chất cặn bã khỏi canh trường bằng phương pháp lọc hay ly tâm. Sử dụng thêm các chất trợ lọc (diatomite, than hoạt tính...) hoặc các chất tạo kết tủa để các chất này dễ dàng bị lắng cặn kéo theo sinh khối giúp quá trình lọc dễ dàng hơn.
Đối với enzyme nội bào thì cần phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp như nghiền trong máy đồng hóa, nghiền với thủy tinh, cát, tự phân dùng tác dụng của siêu âm hoặc áp suất thẩm thấu cao,...
Sau đó, có thể chiết suất enzyme bằng các dung môi khác nhau như nước, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính,... Kết quả ta thu được dịch enzyme và loại bỏ bã sinh khối [4].
1.3.3.2. Thu chế phẩm kỹ thuật (chế phẩm thô)
Chế phẩm kỹ thuật là chế phẩm enzyme chưa được tinh chế có thể chứa một hoặc một vài enzyme chủ yếu ngoài ra trong đó còn có các protein không hoạt động, các tạp chất khác.
Để thu được chế phẩm kỹ thuật, người ta tiến hành cô đặc các dịch enzyme trong thiết bị có độ chân không cao. Sau đó:
- Hoặc tiếp tục cô đặc ở nhiệt độ cao 40 – 450C để đạt nồng độ chất khô 30 - 35 g/l, bổ sung thêm các chất bảo quản NaCl, glicerol, socbitol, benzoate và thu chế phẩm ở dạng lỏng, có thể bảo quản ở nhiệt độ thường 1 – 2 năm.
- Hoặc cho kết tủa enzyme bằng muối trung tính hoặc cồn, ly tâm lấy cặn, rồi cho thêm chất ổn định, đem sấy khô, nghiền mịn và thu chế phẩm.
- Hoặc bổ sung thêm các chất ổn định để đạt nồng độ chất khô 30 - 40 g/l rồi đem sấy phun ở nhiệt độ đầu vào khoảng 1200
Cđầu ra khoảng 600
C [21].
1.3.3.3. Thu chế phẩm enzyme tinh khiết [21]
Việc tinh chế enzyme có thể tiến hành theo nhiều phương pháp và qua nhiều giai đoạn khác nhau.
Đầu tiên loại các protein không hoạt động ra khỏi dịch enzyme bằng phương pháp làm biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của pH và nhiệt độ. Sau đó, ly tâm hoặc lọc bỏ kết tủa để loại chúng ra. Để thu những thành phần có hoạt lực enzyme cao nhất, người ta có thể dùng phương pháp tách phân đoạn khác nhau nhờ kết tủa bằng dung môi hữu cơ, kết tủa bằng muối, hấp thụ chọn lọc, trao đổi ion.
Sau khi làm sạch, cần sấy khô các chế phẩm enzyme để có thể sử dụng lâu dài. Phương pháp sấy khô thường được áp dụng trong trường hợp này là sấy chân không ở nhiệt độ thấp hoặc sấy thăng hoa. Bằng phương pháp làm sạch khác nhau có thể thu được các chế phẩm enzyme có hoạt tính cao hơn nhiều so với chế phẩm ban đầu.
Việc thu chế phẩm tinh khiết và nhất là ở dạng tinh thể rất khó khăn và tốn kém do đó các chế phẩm enzyme loại này chỉ được dùng trong nghiên cứu và y học.
1.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng enzyme protease của Bacillus ở trong
và ngoài nước
Năm 1970, Kerry T. Yasunobu và James Mc Conn đã nghiên cứu tách chiết protease trung tính từ MT nuôi B. subtilis theo phương pháp nuôi bán rắn và nhận thấy protease này là một protease kim loại có ion Ca2+ trong trung tâm hoạt động, có pHopt từ 6,5-7,5, topt là 570C. Protease này bị ức chế bởi Cu2+
, Ni2+, Hg2+, Pb2+, Cd2+, Fe2+ và khi có mặt của ion Ca2+ enzyme này có thể bền trong khoảng pH từ 5,5-10 [59].
Dong Ho Ahn, Hoon Kim và Pack My (1993) đã nghiên cứu về protease tách từ B. megaterimATCC 14945 và nhận thấy enzyme này có thể bị kết tủa bằng ammonium sulphate, có pH thích hợp 7,5, nhiệt độ thích hợp 550C. Protease này cần có ion Ca2+và bị ức chế mạnh bởi EDTA [44].
Gonchar Am và Auslender VI (1996) đã tiến hành nghiên cứu cố định các protease của VK B. subtilis trên 1,4 – polyalkylene oxid bằng phương pháp chiếu