2.3.1. Phương pháp phân lập [27]
Nguyên tắc
- Tách rời các tế bào VSV.
- Nuôi cấy các tế bào trong MT dinh dưỡng đặc trưng để cho KL riêng rẽ, tách biệt nhau.
Cách tiến hành: Trước khi lấy mẫu, các dụng cụ lấy mẫu được thanh trùng bằng cồn. Mẫu được lấy ở 6 khu vườn ở phường Bình Thạnh, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
Lấy 10g đất vườn (khoảng 10g) cho vào bình tam giác có 90ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo huyền phù, được dung dịch pha loãng 10-1
.
Đem gia nhiệt ở nhiệt độ 80 – 850 C trong 15 phút (diệt các tế bào sinh dưỡng và các tế bào không sinh bào tử).
Tiếp tục pha loãng ở các nồng độ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6.
Từ dịch pha loãng 10-4, 10-5, 10-6, nhỏ 1 giọt hoặc 1-2 ml (ở mỗi nồng độ) vào đĩa petri có sẵn MT1. Dùng que trang trải đều dung dịch khắp bề mặt thạch, tiếp tục sử dụng que trang đó trải tiếp 2 đĩa tiếp theo (mỗi nồng độ 3 đĩa).
Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo, ủ ở nhiệt độ phòng trong 24h – 48h. Chọn những KL riêng rẽ cấy vào ống thạch nghiêng.
Phương pháp làm thuần
- Lấy 1 KL riêng rẽ trên ống thạch nghiêng hòa vào nước cất vô trùng, trải lên đĩa lần 2. Nếu các dạng KL đồng đều, có màu sắc giống nhau, soi dưới KHV đều có 1 dạng tế bào, chứng tỏ giống phân lập đã thuần khiết.
- Sau đó chọn các KL riêng rẽ cấy chuyền sang 3 ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa.
2.3.2. Phương pháp cấy truyền giữ giống [27]
Nguyên tắc
-Đảm bảo tốt các điều kiện trong quá trình bảo quản để không thay đổi phẩm chất ban đầu của giống.
-Làm chậm quá trình hô hấp và trao đổi chất ở VSV đồng thời ngăn cản sự sinh trưởng của chúng.
Cách Tiến hành
Chuẩn bị ống thạch nghiêng chứa MT1 đã vô trùng. Dùng que cấy vô trùng, cấy zích zắc trên bề mặt thạch nghiêng. Để ống nghiệm ở 370C, sau 24h – 48h thấy xuất hiện KL thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 40C giữ giống.
Giống được cấy truyền hàng tháng và hoạt hóa trước khi nhân giống.
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn [17], [27], [28]
2.3.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc
Quan sát và miêu tả một số chỉ tiêu của các chủng trên MT1. - Khả năng phát triển của KL.
- Đặc điểm hình thái, kích thước, tính chất bề mặt KL. - Màu sắc KL (mặt phải và mặt trái).
2.3.3.2. Phương pháp nhuộm Gram [17], [27]
Nguyên tắc
Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau.
Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu thuốc nhuộm do không bị rửa trôi khi xử lí bằng cồn. VSV có phức chất này thuộc Gram dương.
Loại phức chất thứ hai không giữ được màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lí bằng cồn và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung. VSV này thuộc Gram âm.
Cách tiến hành (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
VK được nuôi trong MT thạch từ 16 – 24h. Cho một giọt nước cất lên phiến kính, dùng que cấy vô trùng lấy một ít tế bào VK hòa vào giọt nước. Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên đèn cồn. Nhuộm tiêu bản:
- Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi.
- Nhuộm tiêu bản bằng tím gentian qua giấy lọc trong 1 phút. - Nhuộm lugol trong 1 phút.
- Rửa bằng nước cất.
- Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ giọt cồn đến khi tan hết màu.
- Rửa bằng nước cất.
- Nhuộm bổ sung Fuchsin từ 10 – 30 giây.
- Rửa nước, làm khô và quan sát trên KHV với vật kính x100
Đọc kết quả: VK Gram âm sẽ thấy màu hồng, VK Gram dương sẽ thấy màu tím.
2.3.3.3. Phương pháp nhuộm bào tử [17], [27], [28]
Nguyên tắc
Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit. Trước hết xử lí để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính
mạnh. Tẩy màu tế bào chất tế bào đi và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của tế bào và tế bào chất bào tử bắt màu phân biệt.
Cách tiến hành
- Làm vết bôi với VK nuôi cấy 2 tuần tuổi trên ống thạch nghiêng và để vết bôi khô tự nhiên.
- Cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn.
- Nhuộm xanh metylen, hơ nóng phía dưới và giữ trong 1 phút (nếu thuốc cạn phải bổ sung ngay).
- Rửa kĩ vết bôi cho đến khi hết màu. - Nhuộm đỏ trung tính 0,5% trong 1 phút.
- Rửa nước, làm khô và quan sát trên KHV với vật kính x100.
Đọc kết quả: bào tử màu xanh, tế bào chất màu đỏ.
2.3.3.4. Phương pháp xác định khả năng sinh catalase [17], [28]
Nguyên tắc
Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Catalase thủy phân hydrogen perioxide (H2O2) thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ của phân tử có độc tính cao này trong tế bào. Sự thủy phân hydrogen perioxide sẽ giải phóng O2
được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí.
Thử nghiệm này thường được dùng để phân biệt các VSV hiếu khí với kỵ khí như phân biệt Bacillus (+) với Clostridium (-).
Cách tiến hành
Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3% lên trên KL, hoặc chuyển một lượng VSV lên lam rồi thử bằng dung dịch H2O2 3%. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có.
Đọc kết quả
Thử nghiệm là (+) khi có hiện tượng sủi bọt khí do O2 được tạo ra, ngược lại là (-) khi không có sự sủi bọt khí.
2.3.4. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc [26] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyên tắc: Đếm số KL mọc trên MT1 từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem mỗi KL hình thành từ một tế bào duy nhất.
Cách tiến hành
Pha loãng mẫu cần xác định bằng dung dịch nước muối sinh lý. Dùng pipetman chuyển 0,1ml dịch chứa giống VSV lên bề mặt MT trong đĩa petri. Dùng que gạt vô trùng, gạt mẫu thật đều trên mặt thạch. Thực hiện cho 3 dung dịch mẫu có pha loãng các bậc 10 liên tiếp.
Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 300C và ủ trong 48 giờ. Sau thời gian ủ thích hợp, đếm tất cả các KL đã mọc trên đĩa petri. Ghi nhận các nồng độ pha loãng có số KL từ 25 đến 250 KL trên đĩa.
Cách tính kết quả:
Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V Trong đó Ai: số khuẩn lạc trung bình/đĩa
Di: độ pha loãng
V: dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
Mật độ tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi
các nồng độ pha loãng khác nhau.
2.3.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp mật độ quang [17], [24]
Nguyên tắc
Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một phần ánh sáng của các dung dịch có vật chất lơ lửng. Để đánh giá tốc độ phát triển của VK ta có thể đo sự tăng sinh khối qua giá trị OD (Optical Density) ở bước sóng 620 nm (OD620).
Cách tiến hành
Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào.
Pha loãng một lượng huyền phù tế bào thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo OD ở 620nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Xác định giá trị thực tế OD ở 620nm của các huyền phù vừa được pha.
Dùng phương pháp đếm KL, xác định mật độ tế bào (CFU/ml) của huyền phù này.
Tính giá trị log (CFU/ml) cho mỗi giá trị mật độ tương ứng với độ đục. Vẽ đường biểu diễn của log (CFU/ml) (trục tung) theo OD ở 620nm (trục hoành). Xác định khoảng tuyến tính giữa log (CFU/ml)
Xác định mật độ tế bào theo độ đục và OD620.
Sau khi nuôi cấy VK trong MT lỏng với các điều kiện phù hợp với mục đích thí nghiệm trên máy lắc, lấy dịch sau nuôi cấy đo OD bằng máy so màu ở bước sóng 620nm. Tất cả dịch nuôi cấy đều được pha loãng 10 lần trước khi đo OD620. Từ giá trị OD ở bước sóng 620nm đo được suy ra số lượng log (CFU/ml) và trị số mật độ CFU/ml từ đường chuẩn.
2.3.6. Nuôi cấy bề sâu (nuôi cấy chìm) [17]
Phương pháp nuôi cấy bề sâu là phương pháp ở đó VSV phát triển hẳn trong lòng MT. Môi trường nuôi cấy này phải chứa nhiều chất dinh dưỡng, có khả năng hòa tan cao, đầy đủ những thành phần dinh dưỡng cơ bản và dinh dưỡng đặc hiệu. Đặc điểm của phương pháp này là nếu enzyme ngoại bào do VSV tiết vào MT trong suốt quá trình nuôi cấy thì chế phẩm có thể thu được từ nước lọc sau khi tách bỏ VSV.
Cách tiến hành
Chuẩn bị 50ml MT nuôi VK trong các bình tam giác 250ml, đem hấp khử trùng ở 1atm trong 30 phút.
Chuẩn bị ống nghiệm có 10ml nước cất vô trùng.
Cho 10ml nước cất đã vô trùng vào ống nghiệm giống. Dùng que thủy tinh khuấy nhẹ để các tế bào hòa lẫn trong nước. Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 620nm. Dùng pipetman lấy một thể tích huyền phù sao cho mật độ tế bào 106 - 107/ml MT nuôi cấy vào các bình tam giác chứa MT trên.
Đặt bình tam giác lên máy lắc có tốc độ 1500 vòng/phút, nuôi ở nhiệt độ phòng.
2.3.7. Thu dịch enzyme thô [20], [27]
Sau khi nuôi cấy VK trong MT thích hợp tiến hành chiết tách protease ngoại bào ở VK bằng cách:
- Cho dịch nuôi cấy vào ống ly tâm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Ly tâm dịch nuôi cấy VK với tốc độ 5000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch chiết protease ngoại bào. Loại bỏ cặn dưới ta thu được dịch enzyme thô.
- Bảo quản dịch enzyme thô ở 40C.
2.3.8. Phương pháp xác định hoạt tính protease bằng đo đường kính thủy phân [12], [25], [27] [12], [25], [27]
Nguyên tắc
Enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ thạch. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt tính của enzyme.
Cách tiến hành
Nuôi VK trong MT6 như đã trình bày ở mục 2.2. Sau 48h lấy dịch đem ly tâm 5000 vòng/ phút trong 15 phút để thu dịch enzyme.
Đổ MT2, chờ MT đông lại rồi dùng khuyên đục lỗ trên MT thạch để tạo thành giếng.
Dùng pipeman hút dịch enzyme nhỏ vào các giếng trong đĩa petri. Để trong tủ lạnh từ 3-4 tiếng để dịch trong giếng khuếch tán đều, sau đó đặt vào tủ ấm 370C/48h.
Kiểm tra hoạt tính protease: thuốc thử là dung dịch HgCl2. Nếu VK có sinh protease sẽ tạo thành vòng trong suốt quanh lỗ khoan, phần còn lại có màu trắng đục do phản ứng của casein với HgCl2 .
Tiến hành đánh giá khả năng sinh protease bằng cách đo đường kính vòng phân giải D-d (cm). Trong đó D: đường kính vòng phân giải (cm), d: đường kính lỗ thạch (cm).
• D-d ≥ 2,5 cm: rất mạnh. • D-d ≥ 2,0 cm: mạnh. • D-d ≥ 1,5 cm: trung bình. • D-d < 1,0 cm: yếu.
2.3.9. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến [17], [12], [24], [27] [24], [27]
Nguyên tắc
Cho protease tác dụng với casein, sau đó kết tủa protease dư thừa bằng TCA. Sản phẩm tạo thành là các peptid ngắn hay các acid amin, trong các acid amin thì tyrosine chiếm đa số. Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đó xác định hoạt độ enzyme theo định nghĩa: hoạt độ của protease được biểu thị là số µmol Tyrosine sinh ra do thủy phân casein bằng 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn (35,50
C, pH 7,6).
Hóa chất
Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hòa tan 5,96g Na2HPO4.12H2O trong nước thành 250ml.
Dung dịch KH2PO4 1/15M: hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành 100ml.
Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7,6: trộn 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23ml dung dịch KH2PO4 1/15M đo và chỉnh lại pH cho đúng.
Dung dịch Casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong dung dịch đệm Sorensen cho đến khi tan hoàn toàn rồi định mức lại cho đủ 100ml.
Dung dịch TCA 10%: hòa tan 10g TCA trong nước cho đủ 100ml. Dung dịch NaOH 0,5N: hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml. Thuốc thử Folin (pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1: 4).
Dung dịch HCl 0,2 N: trộn 4,25ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250ml. Dung dịch tyrosin 20mM/l: khuấy nghiền 0,118g tyrosin trong dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 50ml.
Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM/l trong dung dịch HCl 0,2N: pha loãng 5ml dùng dịch tyrosin 20mM/l trong dung dịch HCl 0,2N thành 100ml.
* Dựng đường chuẩn tyrosin
Dung dịch Ống nghiệm
0 1 2 3 4 5
Dung dịch Tyrosine chuẩn
1mM/ l (ml) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Dung dịch HCl 0,2N (ml) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lượng Tyrosine (μmol) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Lắc và để yên 10 phút, đem đo mật độ quang ở bước sóng 660nm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ống số 1 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường chuẩn tyrosin tương quan giữa lượng tyrosin (µM) và ∆ OD (∆ OD = ODTN – ODKC).
* Xác định hoạt tính enzyme
Dung dịch hóa chất Ống thật (3 ống) Ống không (3 ống) Ống nghiệm
Dung dịch casein 1% (ml) 5 5 Dung dịch TCA 10% (ml) 0 5 Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 0
Lắc đều và giữ ở 35,50C trong 30 phút
Dung dich TCA 10% (ml) 5 0 Dung dịch enzyme mẫu (ml) 0 1
Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu Dung dịch lọc (ml) 1 1 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6
Lắc đều, để yên sau 10 phút, đo OD ở bước sóng 660nm.
Công thức tính
Hoạt độ protease:
(UI/ml)
Trong đó x: Số ml tyrosine suy ra từ đường chuẩn. V: Tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme.
L: Độ pha loãng mẫu enzyme t: Thời gian hỗn hợp phản ứng. v: Thể tích dịch lọc đem phản ứng.
2.3.10. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry [11]
Nguyên tắc
Hầu hết các emzyme đều chứa tyrosin và tryptophan, hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng một loại với nhau sẽ chứa hàm lượng acid amin này như nhau.
Khi cho tác dụng protein với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu, màu này tỉ lệ với hàm lượng của tyrosin và tryptophan (hàm lượng protein). Vì vậy ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích với những mẫu chuẩn có nồng độ protein đã biết.
* Hóa chất sử dụng
Dung dịch albumin 0,1%: Cân chính xác 0,1g albumin pha với nước cất thành 100ml.
Dung dịch A: Cân 2g Na2CO3 hòa tan trong NaOH 0,1N thành 100ml.
Dung dịch B: Cân 0,5g CuSO4.5H2O hòa tan trong citrat natri 1% pha thành 100ml.
Dung dịch C: Pha dùng trong ngày, gồm dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1. Thuốc thử Folin.
Cách tiến hành:
- Hút 1ml dung dịch protein cho vào ống nghiệm, thêm 5ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ t0
- Thêm vào 0,5ml thuốc thử Folin, lắc đều và để yên ở nhiệt độ t0 = 300C, thời gian t = 30p.
- Đo mật độ quang tại bước sóng λ= 750 nm.
- Đồng thời làm ống kiểm tra như trên nhưng thay protein bằng nước cất.
Dựng đường chuẩn:
Thực hiện đường chuẩn với albumin bò đông khô, từ dung dịch albumin chuẩn ta tiến hành pha loãng theo bảng sau:
Hút 1ml dung dịch albumin chuẩn có các nồng độ khác nhau và thực hiện các phản ứng như trên. Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (OD) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});