Nguyên tắc
Hầu hết các emzyme đều chứa tyrosin và tryptophan, hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng một loại với nhau sẽ chứa hàm lượng acid amin này như nhau.
Khi cho tác dụng protein với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu, màu này tỉ lệ với hàm lượng của tyrosin và tryptophan (hàm lượng protein). Vì vậy ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích với những mẫu chuẩn có nồng độ protein đã biết.
* Hóa chất sử dụng
Dung dịch albumin 0,1%: Cân chính xác 0,1g albumin pha với nước cất thành 100ml.
Dung dịch A: Cân 2g Na2CO3 hòa tan trong NaOH 0,1N thành 100ml.
Dung dịch B: Cân 0,5g CuSO4.5H2O hòa tan trong citrat natri 1% pha thành 100ml.
Dung dịch C: Pha dùng trong ngày, gồm dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1. Thuốc thử Folin.
Cách tiến hành:
- Hút 1ml dung dịch protein cho vào ống nghiệm, thêm 5ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ t0
- Thêm vào 0,5ml thuốc thử Folin, lắc đều và để yên ở nhiệt độ t0 = 300C, thời gian t = 30p.
- Đo mật độ quang tại bước sóng λ= 750 nm.
- Đồng thời làm ống kiểm tra như trên nhưng thay protein bằng nước cất.
Dựng đường chuẩn:
Thực hiện đường chuẩn với albumin bò đông khô, từ dung dịch albumin chuẩn ta tiến hành pha loãng theo bảng sau:
Hút 1ml dung dịch albumin chuẩn có các nồng độ khác nhau và thực hiện các phản ứng như trên. Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ albumin chuẩn (µg/ml).
Tính toán kết quả
Từ đường chuẩn, so sánh mật độ quang của ống nghiệm có chứa mẫu protein, từ đó suy ra hàm lượng protein trong mẫu (µg/ml).
Hoạt độ riêng của chế phẩm được biểu diễn bằng tổng đơn vị hoạt độ trên 1mg protein của chế phẩm enzyme.
Hoạt độ riêng (Hđr) được tính theo công thức:
Hđr = (UI/mg protein)