Để thu nhận chế phẩm protease từ VSV cũng như các enzyme khác có thể dùng hai phương pháp nuôi cấy: phương pháp nuôi cấy bề mặt (phương pháp nổi) và phương pháp bề sâu (phương pháp chìm) [16].
Nuôi cấy bề mặt
Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng sử dụng phương pháp nuôi cấy bề mặt kinh tế hơn. Chủng VSV có thể tạo ra một hệ enzyme ngoại bào đa dạng và sản phẩm không cần tinh sạch nên phương pháp nuôi cấy bề mặt được sử dụng nhiều trong sản xuất men tiêu hóa dùng trong chăn nuôi [80].
Nguyên liệu thường được dùng tạo ra MT bán rắn để nuôi cấy NS và một số VK thường là cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê. Để làm tăng độ xốp của MT bán rắn người ta thường bổ sung trấu hay lõi ngô đã được làm nhỏ (12 - 20%). Mặt khác, để tăng cường quá trình sinh tổng hợp enzyme cảm ứng người ta thường cho thêm vào MT những cơ chất có tính cảm ứng cho enzyme này.
pH trong phương pháp nuôi cấy bề mặt thay đổi theo chủng VSV: 5,6 – 6,2 đối với NS và 6,2 – 7,2 đối với VK ở nhiệt độ duy trì 28 - 300C, độ ẩm không khí 75 – 95% trong thời gian 36 - 72 giờ. Đối với mỗi chủng VSV, cần lựa chọn thời gian nuôi thích hợp mà lượng enzyme trong MT lớn nhất. Độ ẩm MT nên vào khoảng 58 – 60%.
Ưu điểm: nồng độ enzyem tạo thành ở MT bán rắn cao hơn nhiều so với dịch nuôi cấy theo phương pháp chìm sau khi đã tách tế bào VSV.
Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính của enzyme, chế phẩm khô, dễ dàng bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp trong điều kiện không cần enzyme tinh sạch.
Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt còn có một ưu điểm nữa là không cần thiết bị phức tạp. Nuôi cấy trong điều kiện không cần vô trùng tuyệt đối và nếu bị tạp nhiễm phần nào thì loại bỏ phần đó.
Nuôi cấy chìm
Hiệu suất lên men chìm dễ cơ khí hóa, tự động hóa, ít nhân công và có thể sản xuất liên tục là những ưu điểm lớn mà hiện nay nhiều sản xuất chọn phương pháp nuôi cấy chìm để sản xuất enzyme.
Trong phương pháp này, VSV phát triển trong MT lỏng có sục khí và khuấy đảo liên tục. Nguồn carbon trong phương pháp này thường là tinh bột, rỉ
đường,… Nguồn nitơ thường là cao ngô. Ngoài những nguồn cơ chất và khoáng như trong phương pháp nuôi cấy bề mặt, trong phương pháp nuôi cấy chìm, người ta còn bổ sung thêm các chất cảm ứng cho việc sinh tổng hợp enzyme. Các chất cảm ứng này có thể là cơ chất hoặc không phải là cơ chất của enzyme cần phản ứng.
Phương pháp nuôi cấy chìm đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng MT dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy nên không thích hợp với các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ. Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản, nên cấy trực tiếp VK vào thùng men (chứ không qua giai đoạn nuôi cấy trung gian) sẽ đảm bảo MT khỏi bị nhiễm.
Protease sản xuất trên MT khuấy trộn và MT rắn có pH và nhiệt độ hoạt động tối ưu tương tự nhau, tuy nhiên việc nuôi cấy trên MT rắn cho protease có độ bền với nhiệt độ và pH cao hơn so với nuôi cấy trên MT khuấy trộn [74].