* Phương pháp SPS 3.1. Cách ủ mẫu
- Mẫu đưa về phịng thí nghiệm, mở ra cho vào khay vơ trùng. Dùng kéo và kẹp vơ trùng lấy đại diện 25g mẫu cho vào bao PE vơ trùng. Mẫu được đồng nhất với 225ml dung dịch BPW bằng máy dập mẫu để cĩ dung dịch pha lỗng 10-1.
- Dùng pipet vơ trùng hút 1ml dung dịch pha lỗng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch BPW để được dung dịch pha lỗng 10-2. Tùy theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu mà tiến hành pha lỗng ở các nồng độ cao hơn.
3.2. Cấy và ủ mẫu
- Lấy 1ml mẫu đã pha lỗng, đồng nhất cho vào đĩa petri
- Cho 15 - 20 ml thạch SPS vào mỗi đĩa, đảo đĩa, trộn đều. Để đơng lại - Lật úp đĩa, để trong bình kỵ khí. Ủ 35 - 370C trong 24h.
3.3. Đọc kết quả
- Đếm tất cả các khuẩn lạc đặc trưng của Clostridium perfringens (trịn, đen, cĩ đường kính 3mm).
3.5. Tính tốn kết quả
Số khuẩn lạc trong 1g mẫu bằng trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ cĩ trong 2 ống nghiệm nuơi cấy (cùng nồng độ) nhân với hệ số pha lỗng tương ứng và chia cho 10.
* Phương pháp Wison Blair cải tiến
3.6. Chuẩn bị mẫu phân tích tại phịng thí nghiệm
- Mẫu đưa về phịng thí nghiệm, mở ra cho vào khay vơ trùng. Dùng kéo và kẹp vơ trùng lấy đại diện 25g mẫu cho vào bao PE vơ trùng. Mẫu được đồng nhất với 225ml dung dịch BPW bằng máy dập mẫu để cĩ dung dịch pha lỗng 10-1.
- Dùng pipet vơ trùng hút 1ml dung dịch pha lỗng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch BPW để được dung dịch pha lỗng 10-2. Tùy theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu mà tiến hành pha lỗng ở các nồng độ cao hơn.
3.7. Cấy và ủ mẫu
- Chọn 2 nồng độ pha lỗng thích hợp. Cho 10ml dung dịch pha lỗng (mỗi nồng độ 2 ống) vào ống nghiệm cĩ chứa mơi trường Wilson Blair cải tiến làm nguội ở 45oC. Cho thêm 2ml dung dịch Na2SO3 và 5 giọt phèn sắt 5%. Tiếp tục làm như sau:
- Lắc đều
- Đun cách thủy 75oC, 15 phút - Làm đơng nhanh
- Ủ 37oC trong bình kỵ khí trong thời gian 18 - 24 giờ
3.8. Đọc kết quả
Đếm tất cả các khuẩn lạc đặc trưng của Clostridium perfringens (trịn, đen, cĩ đường kính 3mm).
3.9. Tính tốn kết quả
Số khuẩn lạc trong 1g mẫu bằng trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ cĩ trong 2 ống nghiệm nuơi cấy (cùng nồng độ) nhân với hệ số pha lỗng tương ứng và chia cho 10.
4. Những điểm cần lưu ý
- Phèn sắt và Na thiosulfat cần pha riêng rẽ và bổ sung sau khi hấp tiệt trùng.
- Chủng Clostridium perfringens là loại vi sinh vật nguy hiểm, cẩn thận trong quá trình thực hành. Mang khẩu trang và găng tay để tránh bị xâm nhiễm. Các dung dịch vi sinh vật, dụng cụ và mơi trường nuơi cấy cần được hấp tiệt trùng cẩn thận sau khi thí nghiệm.
- Để kết quả phân tích chính xác, nên sử dụng mơi trường tổng hợp dạng đơng khơ cho tất cả các bước thử nghiệm.
5. Báo cáo thực tập
- Trình bày đặc tính sinh lý và gây bệnh của Clostridium perfringens? - Trình bày quy trình phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm?
- Giải thích cơ chế của các thử nghiệm sinh hĩa sử dụng trong quá trình phân tích xác định Clostridium perfringens?
Quy trình phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm:
Trang 133 Đồng nhất mẫu, xử lý mẫu 80oC
Cấy trên đĩa với mơi trường SPS ở 45oC, lắc đều
Bổ sung thêm mơi trường SPS
Ủ 37oC trong bình kỵ khí, trong 24 – 48 giờ
BÀI 25