* Mơi trường KIA (Kligler's Iron Agar)
- Cao thịt : 3g - Cao nấm men : 3g - Pepton : 15g - Proteose Pepton : 5g - NaCl : 5g - Lactose : 10g - Glucose : 1g - Sắt sunfat : 0,2g - Natrithiosunfat : 0,3g - Đỏ trung tính 0,5% : 6ml - Agar : 12g - Nước cất, đủ : 1000ml
Cách pha : Đun sơi để hịa tan hồn tồn thành phần trên trong nước cất, để nguội đến 450C trong nồi cách thủy, chỉnh pH là 7,4 ở 250C. Rĩt vào các ống nghiệm để làm thạch
Trang 111 Hình. Khuẩn lạc của Salmonella
nghiêng một lượng sao cho khi mơi trường đơng lại thì thể tích phần đáy gấp đơi phần nghiêng
* Mơi trường TSI (Triple Sugar Iron Agar) - Cao thịt : 4g - Pepton : 4g - Dextrose : 1g - Lactose : 10g - Saccharose : 10g - NaCl : 5g - Natrithiosunphat : 0,08g - Natrisunfit : 0,4g - Sắt sunfat : 0,2g - Đỏ trung tính1% : 2,5ml - Agar : 15g - Nước cất đủ : 1000ml
Cách pha: Đun sơi để hịa tan hồn tồn thành phần trên trong nước cất, để nguội đến 450C trong nồi cách thủy, chỉnh pH là 7,3 ở 250C. Rĩt vào các ống nghiệm để làm thạch nghiêng một lượng sao cho khi mơi trường đơng lại thì thể tích phần đáy gấp đơi phần nghiêng
* Mơi trường MIU (Motility Indol Urea Medium)
- Trypton : 30g - Kali dihydrophosphat: 1g - NaCl : 5g - Đỏ phenol 0,25% : 2ml - Agar : 4g - Nước cất, đủ : 1000ml
Cách pha: Đun sơi để hịa tan thành phần trên trongnước cất, lọc qua giấy lọc và hấp thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, điều chỉnh pH là 6,8. Để nguội tới 450C trong nồi cách thủy. Cho thêm vào mơi trường nĩng chảy một lượng Ure 20% theo tỷ lệ 1 ure/ 9 mơi trường. Rĩt vào ống nghiệm cĩ dung tích phù hợp từng lượng 5ml và để thẳng đứng.
Dung dịch Ure được pha bằng nước cất và khử trùng bằng lọc khuẩn. * Mơi trường Lysine Decacboxylase broth (LDC)
- Yeast extract : 3g
- Glucose : 1g
- L-lysine : 5g
- Bromocrezol purple : 0.016g
- pH : 6.1± 0.2
Hồ tan các thành phần, phân phối vào các dụng cụ chứa và khử trùng ở 1210C trong 15 phút.
b. Tiến hành
- Cấy đâm sâu rồi cấy ria vi khuẩn từ những khuẩn lạc nghi ngờ lên ống thạch nghiêng chứa mơi trường TSI hoặc KIA. Cấy đâm sâu vào mơi trường MIU. Cấy sinh khối vào mơi trường LDC, Manitol phenol red broth, MR-VP. Các ống nghiệm được ủ ở 370C trong 24 giờ.
- Trên mơi trường TSI hoặc KIA các khuẩn lạc Salmonella cĩ màu đen : dihydrosunfu (+), giữ nguyên màu đỏ của phần nghiêng: lactose (-), saccharose (-); phần đáy đổi màu từ đỏ sang vàng: dextrose hoặc glucose (+), tạo những bọt khí trongnền thạch, cĩ sinh hơi
- Trên mơi trường MIU Salmonella mọc lan khỏi đường cấy thẳng → cĩ tính di động, khơng làm biến màu mơi trường từ hồng nhạt sang đỏ đậm: Urease (-). Cho lên bề mặt mơi trường MIU 0,5 ml thuốc thử Kovac, Salmonella khơng làm đỏ thuốc thử: indol (-)
- Trên mơi trường LDC Salmonella phát triển sẽ làm đục và chuyển màu mơi trường từ vàng sang tím (LDC (+), LDC (-) khi mơi trường cĩ màu vàng.
- Trên mơi trường Manitol phenol red broth, Salmonella lên men manitol tạo acid, làm mơi trường chuyển từ hồng nhạt sang vàng → Manitol (+)
- Trên mơi trường MR-VP, Salmonella cho thử nghiệm VP (-)
3.4. Đọc kết quả thử nghiệm sinh hĩa xác định Salmonella
Mẫu cĩ Salmonella khi:
- Làm đục mơi trường tăng sinh
- Tạo khuẩn lạc đặc trưng trên mơi trường phân lập - Trực khuẩn Gram âm
- Cĩ tính di động
- Lactose (-), Saccharose (-) - Dextrose hoặc Glucose (+) - Dihydrosunfua (+) - Urease (-) - Indol (-) - Manitol (+) - VP (-) 4. Những điểm cần lưu ý
- Salmonella là nhĩm vi sinh vật nguy hại, cần hết sức cẩn thận khi phân tích. Mang găng tay, khẩu trang trong quá trình làm thí nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Các mơi trường tăng sinh chọn lọc, mơi trường phân lập Salmonella cĩ các thành phần dễ biến tính ở nhiệt độ cao, do đĩ, khơng được hấp tiệt trùng khi pha chế.
5. Báo cáo thực tập
- Trình bày quy trình phân tích Salmonella trong thực phẩm?
- Tại sao khi phân tích Salmonella trong thực phẩm, chỉ cần phân tích định tính? - Giải thích cơ chế của các phản ứng sinh hĩa xác định Salmonella?
- Nêu kết quả và kết luận về sự hiện diện của Salmonella trong mẫu thực phẩm ban đầu?
Quy trình phân tích định tính Salmonella
Trang 114 Đồng nhất 25g mẫu với 225g BPW
Chuyển 0,1ml canh khuẩn sang ống nghiệm chứa 10ml Selenite Cystine
Broth hoặc RV
Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 16 – 24 giờ
Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ
Cấy phân lập sang mơi trường XLD và HE
Chọn khuẩn lạc đặc trưng: trong suốt, cĩ hay khơng cĩ tâm đen, cấy sang TSA hay BHI
Ủ ở 37 ± 0,5oC trong khoảng 24 giờ
Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm
Cấy chuyền vào mơi trường thử nghiệm sinh hĩa: KIA, Mannitol Phenol Red Broth, Urea Broth, Lysine Decarboxylase Broth
Canh Trypton, MRVP
Ủ ở 37 ± 0,5oC trong khoảng 24 giờ
Biểu hiện của Salmonella
Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, H2S (+),Gas (+) Urea (-); indol (-); mannitol (+); LDC (+), VP(-)
Ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá
BÀI 21