STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG THỰC PHẨM
1. Nguyên tắc
Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) được Robert Koch phát hiện vào năm 1878 thơng qua phân lập từ mủ của các ung nhọt. Staphylococcus aureus thuộc họ Micrococcaceae (cầu khuẩn). Tụ cầu khuẩn hiện nay được phát hiện cĩ 20 loại , được chia làm 2 nhĩm: nhĩm coagulase (+) và coagulase (-). Staphylococcus aureus thuộc loại coagulase (+). Hiện diện ở nhiều nơi trong mơi trường và trên cơ thể người. Gây nhiều bệnh nguy hiểm trên da, trong cơ thể bằng cách tiết các độc tố như hyaluronidase, hemolysine, leukocidine, exfoliatine, 5 độc tố ruột enterotocxine A, B, C, D, E và độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc.
Nguyên tắc phát hiện sự hiện diện và định lượng số lượng của Staphylococcus aureus
trong thực phẩm dựa vào sự xuất hiện của khuẩn lạc điển hình (chỉ định bởi sự khử của Kali tellurite và lịng đỏ trứng) trên mơi trường phân lập Baird-Parker và phản ứng dương tính coagulase trong dịch huyết tương thỏ.
2. Dụng cụ, mơi trường và hĩa chất2.1. Dụng cụ 2.1. Dụng cụ
STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhĩm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú
1 Giá ống nghiệm Cái 1
2 Ống nghiệm Ф18 Cái 15
3 Bình tam giác 250ml Cái 1
4 Cốc 100ml Cái 1 5 Bình tia Cái 1 6 Pipette 1ml Cái 5 7 Pipette 10ml Cái 1 8 Micropipette 100-1000μl Cái 1 9 Đầu týp 1000μl Cái 1
STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú
1 Nồi hấp cao áp Cái 1
2 Tủ cấy vơ trùng Cái 1
3 Tủ sấy Cái 1
4 Máy dập mẫu Cái 1
5 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1
2.2. Mơi trường và hố chất
- Mơi trường BPA bổ sung kali tellurite và lịng đỏ trứng - Huyết tương thỏ đơng khơ
- Nước muối sinh lý 0,9% - Thuốc nhuộm tím kết tinh - Dung dịch lugol
- Thuốc nhuộm Fuschin - Cồn 96o
* Dung dịch Saline Peptone Water (SPW)
Được sử dụng để pha lỗng vi sinh vật, thành phần như sau:
- Pepton :1g
- NaCl :8,5g
- Nước cất đủ :1000ml
Phân phối 9ml vào các ống nghiệm và 90ml vào các erlen. Hấp khử trùng 121oC, 15 phút. pH cuối = 7,0.
* Mơi trường Baird-Parker
- Tryptone 10g
- Cao thịt 5g - Cao nấm men 1g - Sodium pyruvate 10g - Glycine 12g - Lithium chloride.6H2O 5g - Agar 20g - Nước cất đủ 1000ml Hấp khử trùng 121oC, 15 phút. pH cuối = 7,0± 0,2.
Mơi trường hồn chỉnh: thêm 5ml Bacto EY tellurite enrichment được làm ấm 45oC vào 95ml mơi trường cơ bản được đun chảy và làm nguội ở 45oC, trộn đều và đổ 10 - 15ml vào các đĩa pettri vơ trùng.
* Mơi trường Trypticase Soy Agar (TSA):
Được sử dụng để bảo quản, phục hồi vi sinh vật trong quá trình thí nghiệm - Trypticase peptone 15g
- Phytone peptone 5g
- NaCl 5g
- Nước cất đủ 1000ml
Đun nĩng, phân phối mơi trường vào các ống nghiệm, hấp khử trùng 15 phút, 121oC. Đặt ống nghiệm nghiêng. pH cuối = 7,3±0,2.
2.3. Nguyên liệu khác
- Mẫu thịt heo tươi - Túi nilon dập mẫu
- Dịch vi khuẩn Staphylococcus aureus kiểm chứng
3. Tiến hành thí nghiệm
3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích
- Mẫu đưa về phịng thí nghiệm, mở ra cho vào khay vơ trùng. Dùng kéo và kẹp vơ trùng lấy đại diện 10g mẫu cho vào bao PE vơ trùng. Mẫu được đồng nhất với 90ml dung dịch SPW bằng máy dập mẫu để cĩ dung dịch pha lỗng 10-1.
- Dùng pipet vơ trùng hút 1ml dung dịch pha lỗng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch SPW để được dung dịch pha lỗng 10-2. Tùy theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu mà tiến hành pha lỗng ở các nồng độ cao hơn.
3.2. Cấy và ủ mẫu
- Chọn nồng độ pha lỗng thích hợp, cấy 0,1ml dịch pha lỗng vào đĩa mơi trường Baird Parker, dùng que cấy tam giác trải đều mẫu cho đến khi khơ. Thực hiện tương tự với 2 đĩa mơi trường Baird Parker khác. Ủ 37oC trong 24 - 48 giờ.
Hình. Khuẩn lạc đặc trưng của Staphylococcus aureus trên mơi trường BPA
3.3. Đọc kết quả
- Đếm riêng số khuẩn lạc đặc trưng Nt (trịn, đen, bĩng, cĩ quầng sáng, quầng trong xung quanh khuẩn lạc) và khơng đặc trưng Na của Staphylococcus aureus.
- Cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc khơng đặc trưng sang ống thạch nghiêng TSA. Ủ 30oC trong 24 giờ.
3.4. Phép thử khẳng định
* Thử nghiệm catalase
- Mục đích: chẩn đốn phân biệt khĩm vi khuẩn Staphylococci với khĩm vi khuẩn
Streptococci và Pneumococci. Staphylococci cĩ emzyme catalase sẽ phĩng thích O2 từ H2O2 tạo hiện tượng sủi bọt.
- Thử nghiệm được thực hiện bằng cách hồ một ít sinh khối vi sinh vật lấy trực tiếp từ khuẩn lạc trên mơi trường BPA vào giọt H2O2 trên lame kính. Kết quả:
+ Hiện tượng sủi bọt xảy ra ngay lập tức sau khi H2O2 tiếp xúc với vi khuẩn cĩ catalase (+) → cocci này là Staphylococci.
+ Khơng cĩ hiện tượng sủi bọt: catalase (-) → nhĩm cocci này là Streptococci
* Thử nghiệm coagulase
- Cấy sinh khối vi khuẩn từ mơi trường TSA sang các ống nghiệm chứa huyết tương thỏ, ủ 37oC.
- Theo dõi kết quả phản ứng đơng huyết tương sau 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Staphylococcus aureus cho phản ứng huyết tương dương tính (cĩ khối đơng huyết tương hình thành).
3.5. Tính tốn kết quả
Mật độ Staphylococcus aureus trong 1g mẫu (CFU/g): Trong đĩ:
- f: hệ số pha lỗng, V: thể tích mẫu cấy - n: số đĩa thoả điều kiện
- Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng
- Na: tổng số khuẩn lạc khơng đặc trưng
- Rt: tỉ số giữa khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc đặc trưng
- Ra: tỉ số giữa khuẩn lạc khơng đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc khơng đặc trưng
4. Những điểm cần lưu ý
- Staphylococcus aureus là nhĩm vi sinh vật nguy hại, cần hết sức cẩn thận khi phân tích. Mang găng tay, khẩu trang trong quá trình làm thí nghiệm.
- Thử nghiệm coagulase cĩ thể thực hiện trên dịch huyết tương thỏ đơng khơ hoặc dịch huyết tương thỏ tươi.
- Dung dịch H2O2 dùng làm thử nghiệm coagulase phải được bảo quản ở nhiệt độ thấp để tránh làm mất hoạt tính khi sử dụng.
5. Báo cáo thực tập
- Trình bày đặc tính và độc tính của vi khuẩn Staphylococcus aureus? - Trình bày quy trình phân tích định lượng Staphylococcus aureus? - Ý nghĩa của việc xác định chỉ số Ht và Ha?
- Xác định kết quả phân tích định lượng Staphylococcus aureus trong mẫu thịt ban đầu?
Hình. Kết quả thử nghiệm coagulase trên dịch huyết tương thỏ (âm tính: I, dương tính: II, III, IV, V) Trang 122 ) ( 1 a a t tR N R N nVf S = +
Quy trình phân tích Staphylococcus aureus trong thực phẩm:
Trang 123 Cấy 0,1 – 0,3 ml dung dịch mẫu (10-1) lên bề mặt mơi trường
Baird Parker agar, trang đều bằng que tam giác Cấy 0,1 – 0,3 ml dung dịch mẫu (10-1) lên bề mặt mơi trường
Baird Parker agar, trang đều bằng que tam giác Ủ ngược đĩa ở 37 ±
0,5oC trong 48 giờ
Đếm số khuẩn lạc đặc trưng (N t) và số khuẩn lạc khơng đặc trưng (Na) Đếm số khuẩn lạc đặc trưng (Nt) và
số khuẩn lạc khơng đặc trưng (Na)
Chuyển 5 kl đặc trưng và 5 kl khơng đặc trưng sang mt TSA
Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm
Cấy chuyền vào ống chứa 0,3ml huyết tương Cấy chuyền vào ống chứa 0,3ml huyết tương
Ủ ở 37 ± 0,5oC và theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ. Nếu khơng cĩ kết quả dương tính sẽ ủ đến 24 giờ. Xác định tỉ lệ dương tính Rt (KL đặc trưng) và Ra(KL khơng đặc trưng)
Kết quả: số S. areus (CFU/g) ) ( 1 a a t tR N R N nVf S= +
BÀI 23