COLI TRONG THỰC PHẨM
1. Nguyên tắc
Escherichia coli lần đầu tiên được Escherich phân lập từ phân người vào năm 1855. Đây là vi khuẩn được chú ý nhiều và nghiên cứu kỹ lưỡng nhất. Chúng cư trú ở đường ruột của người và động vật máu nĩng. Chúng cĩ thể là vi khuẩn gây bệnh cơ hội. E. coli là vi sinh vật chỉ thị tiêu biểu nhất. Sự cĩ mặt cũng như số lượng của chúng chỉ ra mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như sự ơ nhiễm phân trong mơi trường. Từ năm 1982 đã phát hiện thấy 4 lồi E. coli cĩ khả năng gây bệnh cĩ nguồn gốc thực phẩm (Enteropathogenic-EPEC; Enteroinvasive-EIEC; Enteroinvasive- EIEC; Enterotoxigenic - ETEC, trong đĩ cĩ chủng O157:H7).
Phương pháp phân tích E. coli trong bài này được dựa trên quy trình MPN bằng sử dụng canh thang Lauryl sulphate tryptose (LST) vào test đốn chừng (presumptive test), sau đĩ dùng canh thang BGLB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) và ủ ấm ở 37oC/24-48 h (để kiểm tra Coliforms). Tiếp theo chuyển sang mơi trường canh EC (E. coli medium) ủ ở 44.5oC để kiểm tra Coliforms chịu nhiệt. Sau đĩ xác định Coliforms phân (E. coli giả định) bằng cách cấy sang mơi trường EMB (Eosine Methylene Blue Agar), chọn khuẩn lạc điển hình và thử khả năng sinh Indol (I). Để xác định E. coli cần thử ba phản ứng sinh hĩa tiếp theo là Methyl Red (MR), Voges-Proskeur (VP) và Citrate (iC). E. coli là Coliforms phân và cho kết quả thử nghiệm IMViC là + + - -.
2. Dụng cụ, mơi trường và hĩa chất2.1. Dụng cụ 2.1. Dụng cụ
STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhĩm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú
1 Giá ống nghiệm Cái 1
2 Ống nghiệm Ф18 Cái 15
3 Bình tam giác 250ml Cái 1
4 Cốc 100ml Cái 1 5 Bình tia Cái 1 6 Pipette 1ml Cái 5 7 Pipette 10ml Cái 1 8 Micropipette 100-1000μl Cái 1 9 Đầu týp 1000μl Cái 1 10 Ống Durham Cái 18
STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú
1 Nồi hấp cao áp Cái 1
2 Tủ cấy vơ trùng Cái 1
3 Tủ sấy Cái 1
4 Máy dập mẫu Cái 1
2.2. Mơi trường và hố chất
- Mơi trường BGBL - Mơi trường EC broth - Mơi trường EMB
- Mơi trường triptose broth - Mơi trường MR-VP
- Mơi trường Simmon citrate - Nước muối sinh lý 0,9% - Cồn 96o
2.3. Nguyên liệu khác
- Thịt tươi
- Túi nilon dập mẫu
- Dịch vi khuẩn Escherichia coli kiểm chứng
3. Tiến hành thí nghiệm
3.1. Nuơi cấy Escherichia coli
- E. coli là dạng coliform cĩ nguồn gốc từ phân, phát triển được ở 44±0,50C, sinh indol, sinh acid, khơng sinh aceton và khơng dùng citrat làm nguồn cacbon.
- E. coli được phát hiện do khả năng lên men lactose sinh hơi ở 44±0,50C và cĩ kết quả nghiệm pháp IMVIC phù hợp.
- Qui trình phân tích định lượng E .coli theo phương pháp MPN thực hiện như sau:
Trang 104
Lấy 10g (10ml) mẫu đồng nhất vào 90ml nước muối sinh lý, được 10-1
Pha loãng mẫu 10-2, 10-3, 10-4…
Chuyển 1ml dung dịch 10-2, 10-3, 10-4 vào 10ml canh BGBL, mỗi nồng độ 3 ống lặp lại, ủ 37oC, 36h Chọn ống (+), cấy sang canh EC, ủ 44.0 ± 0.5oC trong 24-48 giờ
Ủ ở 37.0 ± 0.5oC trong 24 giờ
Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim tím, đường kính khoảng 1mm để cấy sang TSA hay BHI
Ủ ở 37.0 ± 0.5oC qua đêm
Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hoá: Canh trypton (1), MRVP (2), Simmon Citrate (1) để thử nghiệm
pháp IMViC
Kết luận: Phát hiện (không phát hiện) E.coli/g
E.coli có biểu hiện sinh hoá: Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate (-).Một trong số các phản ứng trên sai là không phải E.coli
Xác định ống (+) ở mỗi nồng độ, cấy sinh khối vi sinh vật từ các ống (+) sang đĩa mơi trường EMB hoặc Endo để phân lập E.coli