PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) 1. Nguyên tắc
Các phương pháp truyền thống phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bao gồm các bước nuơi cấy trên mơi trường chọn lọc và hàng loạt các thử nghiệm hố sinh để khẳng định sự hiện diện của một lồi gây bệnh nhất định, và thường kéo dài vài ngày đến vài tuần. Trong những năm vừa qua, các phương pháp nhanh hơn, chuyên biệt hơn nhằm phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm dựa trên nguyên tắc sinh học phân tử và miễn dịch học như phương pháp lai phân tử, PCR, ELISA…đã được thiết lập. PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật được ứng dụng phổ biến khắc phục được các nhược điểm của phương pháp truyền thống nhờ khả năng phát hiện nhanh và đặc hiệu mầm bệnh. Các nghiên cứu hiện nay trên thế giới đang tập trung vào khẳng định khả năng sử dụng PCR như phương pháp tiêu chuẩn để kiểm tra vệ sinh thực phẩm.
PCR là một kỹ thuật nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA mục tiêu trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt. Kỹ thuật này được nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis phát minh vào năm 1985. Sự phân tích sản phẩm PCR bằng điện di sẽ cho phép phát hiện vi sinh vật mục tiêu dự trên sự so sánh với các trình tự DNA đặc trưng của vi sinh vật chuẩn. Xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR thường cĩ kết quả độ chính xác rất cao, tính đặc hiệu lớn. Tuy nhiên kết quả cũng cịn tùy thuộc trình độ của kỹ thuật viên, phương tiện máy mĩc làm việc và việc quản lý chất lượng.
2. 2. Dụng cụ, mơi trường và hĩa chất2.1. Dụng cụ 2.1. Dụng cụ
STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhĩm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú
1 Giá ống nghiệm Cái 1
2 Ống nghiệm Ф18 Cái 15
3 Bình tam giác 250ml Cái 1
4 Cốc 100ml Cái 1 5 Bình tia Cái 1 6 Pipette 1ml Cái 5 7 Pipette 10ml Cái 1 8 Micropipette 100-1000μl Cái 1 9 Đầu týp 1000μl Cái 10
10 Ống Eppendorf 0,2. 0,5 ml; 1,5 ml chuyên dùng cho PCR Cái 5
STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú
1 Nồi hấp cao áp Cái 1
2 Tủ cấy vơ trùng Cái 1
3 Tủ sấy Cái 1
4 Máy dập mẫu Cái 1
5 Bình ủ kỵ khí Cái 1
6 Bếp đun cách thủy Cái 1
7 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1
8 Máy PCR Cái 1
9 Máy ly tâm dùng cho ống eppendorf 1,5 ml Cái 1
10 Máy vortex Cái 1
11 Thiết bị điện di ngang và bộ nguồn điện di cĩ điện thế hoạt
Cái 1
STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhĩm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú
động từ 80 đế 150 volt
12 Hộp đèn soi UV cĩ kính lọc 302mm Cái 1
13 Bộ chụp ảnh trên đèn UV Cái 1
2.2. Mơi trường, hĩa chấta. Hĩa chất a. Hĩa chất
* Mồi: Gồm hai mồi invA1 và invA2 được thiết lập cách nhau 520 bp trong gen invA
cĩ vai trị trong quá trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật và người. Trình tự của hai mồi như sau :
invA1 : 5' - TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3'
invA2 : 5' - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG - 3'
Nồng độ mồi sử dụng trong phân tích được pha lỗng thành 6 pM trong đệm TE. Ðệm TE cĩ thành phần như sau : 10 mM Tris-HCl (pH = 8), 1 mM EDTA.
* Hỗn hợp dùng trong khuếch đại PCR 1,1x - Taq polymerase: 0,025 U/ml (1,25 U/50 ml) - Tris - HCl (pH = 8,8 ở nhiệt độ 25oC): 75 mM - Sunphat amon (NH4)2ư SO4: 20 nM
- Tween 20: 0,01% (v/v)
- dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): 200 mM (mỗi loại) - Magiê clorua (MgCl2) 1,5 mM
- Tất cả các thành phần trên được pha chế trong nước cất 2 lần và bảo quản ở nhiệt độ 4oC trong 1 tháng. Cĩ thể bảo quản ở nhiệt độ - 20oC trong 1 năm. Khơng nên rã đơng và tái đơng dung dịch đã pha chế nhiều lần.
* Thang ADN
Nên sử dụng thang đo phù hợp cĩ thể ước lượng được đoạn khuếch đại 520 bp. Cĩ thể sử dụng sản phẩm khuếch đại cĩ kích thước 520 bp đã biết trước làm thang đo trong phương pháp này.
* Agarose
Sử dụng trong kỹ thuật này là loại dùng để điện di ADN cĩ kích thước nhỏ hơn 1000 bp.
* Ðệm điện di TAE 1x - Tris: 4,84 g
- Na2EDTA 0,5M, pH = 8,0: 2 ml - Axit axetic băng: 1,14 ml - Nước cất cho đủ: 1000 ml
Nên pha chế thành dung dịch 10x (đậm đặc 10 lần), khi sử dụng mới pha lỗng với nước thành dung dịch 1x. * Ðệm tải mẫu 6x - Glyxerol: 30 % - Xanh bromphenon: 0,25 % - Tris: 200 mM - Na2EDTA: 20 mM
Các thành phần trên được pha trong nước cất, bảo quản ở nhiệt độ 4oC. * Thuốc nhuộm AND: dung dịch etyl bromua nồng độ 10 mg/ml