3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích
- Dùng pipet vơ trùng hút chính xác 10ml dung dịch mẫu nước cần phân tích cho vào một túi dập mẫu hoặc một bình tam giác vơ trùng. Đối với mẫu rắn cân chính xác 10 g mẫu bằng cân phân tích trong điều kiện vơ trùng.
- Bổ sung thêm 90 ml dung dịch nước muối peptone 1% hoặc nước muối sinh lý vơ trùng.
- Lắc đều bình tam giác hoặc đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 60 giây, 6-7 nhịp /giây, ta được độ pha lỗng 10-1.
Hình. Quy trình chuẩn bị mẫu phân tích
- Tiến hành pha lỗng mẫu: Dùng pipet vơ trùng hút chính xác 1ml dung dịch mẫu ở độ pha lỗng 10-1, tiến hành pha lỗng tiếp thành các độ pha lỗng 10-2, 10-3, 10-4... trên các ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn chứa 9ml dung dịch nước muối peptone 1% vơ trùng hoặc nước muối sih lý vơ trùng.
3.2. Cấy mẫu
- Tiến hành cấy mẫu quy trình đếm Coliforms bằng phương pháp đổ đĩa và ủ ở 37oC/2 ngày để làm mẫu đối chứng.
- Cấy dịch kiểm chứng trên một đĩa Petrifilm theo quy trình như sau: + Đặt tấm petrifilm lên mặt bàn phẳng vơ trùng
+ Dùng tay hoặc dùng kẹp inox lật màng film nilon phủ bề mặt đĩa petrifilm.
+ Dùng pipet vơ trùng hoặc micropipet với đầu tuýp vơ trùng hút chính xác 1ml dung dịch mẫu ở các độ pha lỗng đã lựa chọn nhỏ lên giữa màng mơi trường trên đĩa petrifilm.
+ Lật cuộn màng nilon trở lại cẩn thận để tránh tạo bọ khí, khơng được để tấm màng film nilon rơi xuống
+ Dùng tấm nhựa chặn cĩ mặt phẳng ở bên dưới dàn mỏng giọt dung dịch đều khắp màng mơi trường trong vùng cấy. Dùng một lực nhẹ ấn lên tấm nhựa chặn trải đều mẫu lên vùng cấy trước khi lớp gel hình thành. Tránh xoay hay trượt tấm nhựa chặn mẫu.
+ Lấy tấm nhựa chặn ra để lớp keo đơng lại.
- Tấm petrifilm được nuơi ủ ở nhiệt độ 35-370C trong thời gian 18-24 giờ. Các tấm petrifilm cĩ thể chồng lên đến 20 đĩa.
- Đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng của coliforms và tính kết quả theo phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp bằng mắt hay bằng máy đếm khuẩn lạc. Khuẩn lạc E.coli cĩ màu xanh và sinh khí; khuẩn lạc Coliforms cĩ màu đỏ và sinh khí.
4. Những điểm cần lưu ý
- Khơng sử dụng đĩa này riêng rẻ để phát hiện E. coli O157. Như hầu hết những mơi trường kiểm tra E.coli/coliform khác, đĩa này sẽ khơng hiển thị đặc biệt với bất kì dịng Trang 95
Coliform
E. coli
Khơng phải coliform
Hình. Quy trình cấy mẫu vào đĩa petrifilm và cách nhận diện khuẩn lạc coliforms (màu hồng), E. coli (màu tím xanh) trên đĩa petrifilm
O157 nào hiện diện.
- Thao tác cấy mẫu vào đĩa petrifilm phải cẩn thận tránh làm lẫn bọt khí vào lớp gel - Các tấm petrifilm cĩ thể dùng để phân lập định danh vi sinh vật.
- Sau khi đếm kết quả, các tấm petrifilm phải được hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút trước khi loại bỏ.