CEREUS TRONG THỰC PHẨM
1. Nguyên tắc
Bacillus cereus được phát hiện lần đầu tiên bởi Hauge năm 1949 khi phân tích mẫu xốt vani gây tiêu chảy tại bệnh viện ở Oslo, Na uy.Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố phổ biến trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm. Ngồi các độc tố gây ngộ độc thực phẩm là diarrhoed và emetic, Bacillus cereus cĩ thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau như: nhiễm trùng máu, viêm màng não, và nhiễm trùng mắt.
Quá trình phân tích định lượng Bacillus cereus trong thực phẩm cĩ thể được thực hiện theo phương pháp MPN hoặc phương pháp đếm khuẩn lạc. Khuẩn lạc của Bacillus cereus
trên mơi trường phân lập MYP được xác định bằng các phản ứng sinh hĩa đặc trưng.
2. Dụng cụ, mơi trường và hĩa chất2.1. Dụng cụ 2.1. Dụng cụ
STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhĩm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú
1 Giá ống nghiệm Cái 1
2 Ống nghiệm Ф18 Cái 15
3 Bình tam giác 250ml Cái 1
4 Cốc 100ml Cái 1 5 Bình tia Cái 1 6 Pipette 1ml Cái 5 7 Pipette 10ml Cái 1 8 Micropipette 100-1000μl Cái 1 9 Đầu týp 1000μl Cái 1
STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú
1 Nồi hấp cao áp Cái 1
2 Tủ cấy vơ trùng Cái 1
3 Tủ sấy Cái 1
4 Máy dập mẫu Cái 1
5 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1
2.2. Mơi trường và hố chất
- Dung dịch TSP - Mơi trường MYP - Mơi trường nitrate broth
- Mơi trường phenol red dextrose broth - Nước muối sinh lý 0,9%
- Nước cất vơ trùng.
- Thuốc nhuộm tím kết tinh - Dung dịch lugol
- Thuốc nhuộm Fuschin - Cồn 96o
- Lysozyme
- Mơi trường thạch tyrosin - Mơi trường MR-VP - Mơi trường TSA
* Dung dịch đệm phosphat : được sử dụng để pha lỗng - Dung dịch mẹ
+ KH2PO4 :34g
+ Nước cất :500ml
Chỉnh pH = 7,2. Cho nước cất vào đủ 1000ml. Hấp 121oC, 15 phút. - Pha lỗng để sử dụng
+ Dung dịch mẹ :1,25ml + Nước cất :98,75ml
Phân phối 90ml vào các erlen và 9ml vào các ống nghiệm. Hấp khử trùng 121oC, 15 phút.
* Mơi trường Manitol - Egg - Yolk polymyxin (MYP)
- Cao thịt :1g - Peptone :10g - Mannitol :10g - NaCl :10g - Phenol red :2,5ml - Thạch :15g - Nước cất đủ :900ml pH = 7,2±0,2. Hấp 121oC, 15 phút. Để nguội đến 500C. - Dung dịch Polymixin B 0,1%
Hịa 500.000 đơn vị polymixin B sulfat trong 50ml nước cất vơ trùng. Bảo quản 4oC. - Egg yolk emulsion 50%: sản phẩm thương mại.
Mơi trường hồn chỉnh: bổ sung 2,5ml dung dịch polymixin B và 1,25ml egg yolk emulsion vào 225ml mơi trường thạch cơ bản đã khử trùng và làm nguội 50oC. Trộn đều và đổ 10 - 15ml vào các đĩa petri.
* Mơi trường Phenol Red - Dextrose Broth
Được sử dụng để thử nghiệm khả năng lên men glucose của vi sinh vật. - Proteose peptone No.3 :10g
- Cao thịt :1g - Dextrose :5g - NaCl :5g - Phenol red :0,018g - Nước cất đủ :1000ml Hấp khử trùng 121oC, 10 phút. pH cuối = 7,4±0,2. * Mơi trường Nitrat Broth :
Được sử dụng trong khẳng định sinh hĩa
- Cao thịt :3g - Peptone :5g - KNO3 :1g - Nước cất đủ :1000ml Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút, pH cuối = 7,0±0,2. * Mơi trường MR - VP:
Được sử dụng trong khẳng định sinh hĩa
- Peptone :5g
- Glucose :5g
- Phosphate buffer :5g - Nước cất :1000ml
Phân phối mơi trường vào các ống nghiệm và hấp khử trùng 121oC, 15 phút, pH cuối= 7,5±0,2.
* Mơi trường Trypticase Soy Agar (TSA) :
Được sử dụng để bảo quản, phục hồi vi sinh vật trong quá trình thí nghiệm - Trypticase peptone :15g
- Phytone peptone :5g
- NaCl :5g
- Nước cất đủ :1000ml
Đun nĩng, phân phối mơi trường vào các ống nghiệm, hấp khử trùng 15 phút, 121oC. Đặt ống nghiệm nghiêng. pH cuối = 7,3±0,2.
* Mơi trường thạch Tyrosine:
Dùng để thử nghiệm khả năng phân hủy Tyrosine của Bacillus cereus
- Nutrient agar - Cao thịt :3g - Peptone :5g - Agar :15g - Nước cất đủ :1000ml Hấp khử trùng 121oC, 15 phút. pH cuối = 6,8±0,2. - Dung dịch Tyrosine 5% Tyrosine :5g Nước cất :100ml Hấp khử trùng 121oC, 15 phút.
Mơi trường hồn chỉnh: trộn 90ml mơi trường Nutrient agar đun chảy làm nguội 45oC với 10ml dung dịch Tyrosine 5%, phân phối 10ml vào các đĩa petri.
* Mơi trường Nutrient Broth với lysozyme Nutrient Broth - Cao thịt :3g - Peptone :5g - Nước cất đủ :1000ml Hấp khử trùng 121oC, 15 phút. pH cuối = 6,8±0,2. Lysozyme 0,1% - Lysozyme hydrochloride :0,1g - Nước cất :100ml Lọc bằng màng lọc vơ trùng.
Mơi trường hồn chỉnh: hịa 1ml lysozyme 0,1% với 99ml mơi trường Nutrient Broth, phân phối vào các ống nghiệm.
* Thuốc thử Voges - Proskauer
- a-Naphtol :5g
- Etanol 96% :100ml Bảo quản ở 0 - 5oC trong lọ tối.
* Dung dịch Kali hydroxit 40% (KOH) - Kali hydroxit (KOH) :40g
- Nước cất đủ :100ml * Thuốc thử nitrit Thuốc thử A - Acid sulfanilic :8g - CH3COOH 5N :1000ml Thuốc thử B - a-Napthol : 2,5g - CH3COOH 5N :1000ml Thuốc thử hồn chỉnh - Dung dịch A 0,25ml - Dung dịch B 0,25ml 2.3. Nguyên liệu khác
- Mẫu thịt heo tươi - Túi nilon dập mẫu
- Dịch vi khuẩn Bacillus cereus kiểm chứng
3. Tiến hành thí nghiệm
3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích tại phịng thí nghiệm
- Mẫu đưa về phịng thí nghiệm, mở ra cho vào khay vơ trùng. Dùng kéo và kẹp vơ trùng lấy đại diện 10g mẫu cho vào bao PE vơ trùng trong điều kiện vơ trùng.
- Mẫu được đồng nhất với 90ml dung dịch đệm phosphat bằng máy dập mẫu để cĩ dung dịch pha lỗng 10-1.
- Dùng pipet vơ trùng hút 1ml dung dịch pha lỗng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch đệm phosphat để được dung dịch pha lỗng 10-2. Tùy theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu mà tiến hành pha lỗng ở các nồng độ cao hơn.
3.2. Cấy mẫu lên mơi trường MYP
- Chọn 2 nồng độ pha lỗng thích hợp, hút 0,1ml dịch pha lỗng vào mỗi đĩa MYP (mỗi nồng độ 2 đĩa). Dùng que gạt trải cẩn thận chất nuơi càng nhanh càng tốt. Ủ 30oC, trong thời gian 24 - 48 giờ.
- Chọn và đếm các đĩa cĩ từ 15 - 150 khuẩn lạc đặc trưng của Bacillus aureus (dẹt, đường kính 2 - 3mm, bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh cĩ vịng đục). Chuyển 5 khuẩn lạc nghi ngờ này lên mơi trường phục hồi TSA , ủ ở 30oC qua đêm trước khi tiến hành các thử nghiệm sinh hố.
3.3. Khẳng định Bacillus cereus bằng các phản ứng sinh hĩa
- Thử nghiệm khả năng lên men glucose: cấy vi khuẩn từ mơi trường TSA sang mơi trường thạch glucose, ủ 35oC trong 24 giờ. Bacillus cereus cho phản ứng dương tính làm đổi màu mơi trường từ đỏ sang vàng.
- Thử nghiệm khả năng chuyển hĩa nitrat thành nitrit: cấy vi khuẩn từ mơi trường TSA sang mơi trường nitrat, ủ ở 35oC trong 24 giờ. Bacillus cereus cĩ phản ứng dương tính nên sau khi nhỏ thuốc thử vào canh khuẩn chuyển sang màu đỏ cam trong 10 phút.
- Thử nghiệm Voges - proskauer: cấy vi khuẩn từ mơi trường TSA sang mơi trường canh MR - VP, ủ ở 35oC trong 48 giờ. Bacillus cereus cho phản ứng dương tính: mơi trường chuyển sang màu hồng khi cho thuốc thử a-Naphthol vào (trước khi nhỏ a-Naphthol vào phải làm kiềm hĩa mơi trường nuơi cấy bằng KOH 40%).
- Thử nghiệm Tyrosin: cấy vi khuẩn từ mơi trường TSA sang ống thạch nghiêng Tyrosin, ủ 35oC trong 48 giờ. Khuẩn lạc Bacillus phân hủy tyrosin tạo khoảng trong xung quanh khuẩn lạc.
- Thử nghiệm Lysozyme: cấy vi khuẩn từ mơi trường TSA sang ống nghiệm chứa mơi trường Nutrient Broth với 0,001% lysozyme, ủ 35oC trong 24 giờ. Bacillus phát triển làm mơi trường đục đều.
3.4. Tính tốn kết quả:
Số Bacillus cereus trên 1g mẫu = n V f R N × × × Trong đĩ : Trang 118 Hình. Khuẩn lạc B.cereus trên mơi
trường Mossel
Hình. Khuẩn lạc B.cereus trên mơi trường MYP
N: tổng số khuẩn lạc đếm được n: số lượng đĩa đếm
f: độ pha lỗng tương ứng
V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa
R: tỉ lệ xác nhận = tỉ lệ giữa số khuẩn lạc nghi ngờ cho thử nghiệm dương tính so với số khuẩn lạc nghi ngờ.
4. Những điểm cần lưu ý
- Bacillus cereus là nhĩm vi sinh vật nguy hại, cần hết sức cẩn thận khi phân tích. Mang găng tay, khẩu trang trong quá trình làm thí nghiệm.
- Các mơi trường phân lập Bacillus cereus cĩ các thành phần dễ biến tính ở nhiệt độ cao, do đĩ, khơng được hấp tiệt trùng khi pha chế.
5. Báo cáo thực tập
- Trình bày quy trình phân tích Bacillus cereus trong thực phẩm?
- Tại sao khi phân tích Bacillus cereus trong thực phẩm, chỉ cần phân tích định tính? - Giải thích cơ chế của các phản ứng sinh hĩa xác định Bacillus cereus?
- Nêu kết quả và kết luận về sự hiện diện của Bacillus cereus trong mẫu thực phẩm ban đầu?
Trang 119
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang TSA hay BHI, ủ 30oC, 24h
Lấy 25g mẫu đồng nhất vào 225ml pepton đệm, được 10-1 Pha loãng mẫu 10-2, 10-3, 10-4…
Chuyển 0,1ml dung dịch 10-2, 10-3, 10-4 cấy trải vào đĩa petri mơi trường MYP, ủ 30oC, 30h
Cấy thử sinh hoá: phenol red glucose broth, gram, nitrate broth, VP, Tyrosine agar, Lysozyme broth
Kết luận Bacillus cereus
BÀI 22