2.5.1 Phƣơng pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán [5], [27], [38], [39]
Nguyên lý: Các loại kháng sinh khác nhau đã được tẩm trong các khoanh giấy sẽ khuyếch tán trong đĩa thạch và kìm hãm sự phát triển của chủng vi khuẩn trên bề mặt thạch. Dựa vào đường kính vòng ức chế để đánh giá mức độ nhạy cảm hay đề kháng của kháng sinh.
Các bước tiến hành
- Chủng vi khuẩn thuần nhất được cấy trên môi trường nuôi cấy khác nhau (thạch thường, thạch máu) tùy thuộc từng loại vi khuẩn trong 18-24h
- Pha huyền dịch bằng cách lấy 3 đến 5 vi khuẩn thuần pha vào dung dịch nước muối 0,85% và lắc đều bằng máy vortex, so độ đục chuẩn tương đương Mc Farland 0,5 (tương đương 1,5x108
- Dùng tăm bông vô trùng thấm ướt huyền dịch vừa pha (độ ẩm vừa phải), ria đều vi khuẩn lên mặt đĩa thạch Muleller - Hinton (là môi trường chuẩn để tiến hành kỹ thuật kháng sinh đồ)
- Đặt khoanh giấy kháng sinh vào đĩa bằng kim nhọn, khoảng cách các khoanh khoảng 20-25 mm và cách thành đĩa từ 10-15 mm
- Ủ ấm 35-370C/24h trong tủ ấm thường. Riêng phế cầu phải ủ trong tủ ấm có khí trường 5-10% C02
Nhận định kết quả:
- Đo đường kính vòng ức chế bằng thước đo milimet
- So sánh với bảng giới hạn dành cho chủng mẫu để kiểm tra chất lượng xét nghiệm. Chỉ khi kết quả chủng mẫu đạt yêu cầu mới đọc kết quả trên chủng phân lập từ bệnh nhân
- Đánh giá mức độ nhạy cảm của KS ở 3 mức độ + Nhạy cảm (susceptible): S
+ Trung gian (intermediate): I + Đề kháng (resistant): R
Phiên giải kết quả theo hướng dẫn của CLSI
2.5.2 Phương pháp E-test [39], [44], [59]
Nguyên lý: Sử dụng thanh giấy chứa các nồng độ kháng sinh nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu sự phát triển của vi khuẩn
Tiến hành
- Để đĩa thạch và băng giấy chứa các nồng độ kháng sinh ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
- Lấy 4 hoặc 5 khuẩn lạc vào môi trường nước muối 0.9% và ủ ấm 350C trong 2-8h để đạt độ đục 0.5 Mc Farland
- Lắc đều bằng máy vortex, so độ đục chuẩn tương đương 0.5 Mc Farland (1.5 x 108 CFU/ml).
Bước 2: Ria huyền dịch và đặt băng giấy
- Nhúng tăm bông vào ống đựng huyền dịch, ép nhẹ lên thành ống rồi ria toàn bộ lên mặt thạch.
- Dùng panh đặt băng giấy E-test lên mặt thạch
- Đặt băng giấy lên trên mặt thạch với nồng độ kháng sinh cao nhất ở gần cạnh của đĩa petri. Đối với đĩa có đường kính 90mm, có thể đặt 1 hoặc 2 băng giấy
- Loại bỏ các bóng khí của băng giấy trên mặt thạch bằng cách dùng panh ấn nhẹ nhàng lên băng giấy.
- Không thay đổi vị trí của băng giấy E-test sau khi đã đặt trên mặt thạch. Nếu đặt ngược băng giấy có thể dùng panh lật nhẹ nhàng và đặt lại.
Bước 3: Ủ ấm
- Lật ngược đĩa thạch và ủ ấm 16-20h ở 350C (không chồng quá 5 đĩa trong tủ ấm)
Bước 4: Đọc và diễn giải kết quả
- Mở nắp và đọc đĩa nơi có nguồn sáng.
- Giá trị MIC được đọc dựa vào điểm tiếp xúc giữa vòng ức chế vi khuẩn (hình elip) với điểm tiếp xúc thấp nhất của băng giấy E-test trên mặt thạch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Nhận định kết quả MIC bằng E-test Penicillin với S. suis theo tiêu chuẩn của viện nghiên cứu tiêu chuẩn hóa lâm sàng và xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI)
+ Nhạy cảm: MIC ≤ 0,12 µg/ml + Trung gian: MIC = 0,23-2 µg/ml + Đề kháng: MIC ≥ 4 µg/ml
2.6 Xử lý số liệu
- Các số liệu được thu thập và phân tích bằng phần mềm Whonet 5.4 - Các số liệu được xử lý trên phần mềm thống kê SPSS 11.5
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả nuôi cấy dịch não tủy
Trong thời gian nghiên cứu từ năm 2008 đến 2010, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy 3110 mẫu bệnh phẩm DNT
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi như sau:
3.1.1 Phân bố độ đục dịch não tủy
Bảng 3.1: Phân bố độ đục dịch não tủy
Số lƣợng Độ đục n Tỷ lệ % Đục 305 9,8 Lẫn máu 128 4,1 Vàng chanh 6 0,2 Trong 2671 85,9 Tổng cộng 3110 100
Theo nhận định độ đục dịch não tủy, tỷ lệ dịch não tủy trong chiếm 85,9%, sau đó đến dịch não tủy đục chiếm 9,8%. Dịch não tủy lẫn máu là 4,1% và vàng chanh là 0,2%.
Nhận định độ đục dịch não tủy rất có ý nghĩa trong chẩn đoán sơ bộ căn nguyên gây viêm màng não. Đây là bước cần thiết và quan trọng không chỉ với lâm sàng mà còn cả với xét nghiệm. Dịch não tủy sau khi chọc dò thường đục hoặc lờ đục, lẫn máu, trong hoặc vàng chanh… Dựa trên nhận định này, các bác sỹ lâm sàng cũng như khoa xét nghiệm nhận biết sơ bộ tác nhân gây bệnh.
Trong 3110 bệnh phẩm được chỉ định xét nghiệm, chúng tôi thu thập được 2671 (85,9%) mẫu dịch não tủy trong, dịch não tủy đục (lờ đục) là 305 trường hợp chiếm 9,8%, dịch não tủy lẫn máu là 128 trường hợp và vàng chanh là 6 trường hợp. Kết quả cho thấy lượng bệnh phẩm dịch não tủy trong chiếm đa số số lượng bệnh phẩm trong thời gian nghiên cứu. Trong khi đó dịch não tủy đục thường được nghĩ đến căn nguyên vi khuẩn và nấm gây viêm màng não mủ chỉ chiếm số lượng nhỏ. Kết quả này có thể do chỉ định rộng rãi của bác sỹ lâm sàng nhằm tránh bỏ sót các trường hợp không điển hình hoặc có thể do Bạch mai là bệnh viện tuyến cuối, bệnh nhân được chuyển đến trong tình trạng nặng và đã dùng kháng sinh. Do vậy cần thông báo đến bác sỹ lâm sàng, tránh chỉ định nhiều làm xét nghiệm tăng lên, tăng cao chi phí chữa bệnh cho bệnh nhân.
Quan sát độ đục dịch não tủy chính là bước đầu nhận định sơ bộ căn nguyên gây bệnh. Bước nhận định này, không chỉ giúp xét nghiệm dự đoán kết quả nhuộm soi mà còn định hướng kết quả nuôi cấy.
3.1.2 Kết quả nhuộm soi
TT Tác nhân n %
1 Cầu khuẩn Gram (+) 71 74,7
2 Trực khuẩn Gram (-) 13 13,7
3 Nấm men 11 11,6
Tổng số 95 100
Trong tổng số bệnh phẩm xét nghiệm, nhuộm soi phát hiện vi khuẩn và nấm gây bệnh là 95 trường hợp. Trong đó nhóm cầu khuẩn Gram dương chiếm tỷ lệ 74,6%, nhóm trực khuẩn Gram âm chiếm 13,7% và nấm chiếm 11,6%.
Vấn đề chẩn đoán căn nguyên vi sinh gây viêm màng não các loài vi khuẩn và nấm gây viêm màng não bằng phương pháp nuôi cấy, sinh học phân tử hoặc huyết thanh học ở nước ngoài và một số cơ sở đã trở thành thường quy. Vấn đề cần bàn luận ở đây là trong điều kiện Việt Nam nên tiến hành xét nghiệm tìm tác nhân gây bệnh trong dịch não tủy thế nào cho phù hợp, đặc biệt ở các tuyến tỉnh chưa có điều kiện nuôi cấy.
Qua kinh nghiệm nuôi cấy và phân lập 3110 bệnh phẩm dịch não tủy và kinh nghiệm nuôi cấy nhiều năm trước đó, chúng tôi kết luận: kỹ thuật nhuộm soi phát hiện hình thể và chẩn đoán căn nguyên gây vi khuẩn và nấm gây viêm màng não bằng phương pháp nhuộm soi hình thể có ý nghĩa thực tiễn. Đây là khâu quan trọng và cần thiết cấp bách. Khi nghi ngờ bệnh nhân viêm viêm màng não, ở cả tuyến trung ương và các tuyến y tế cơ sở không có điều kiện nuôi cấy, việc chọc hút dịch não tủy của bệnh nhân để quan sát màu sắc, xét nghiệm sinh hóa và tế bào học phải tiến hành ngay kỹ thuật nhuộm Gram. Khi đã phát hiện hình thể vi khuẩn trong dịch não tủy của bệnh nhân có thể căn cứ vào lứa tuổi và một số yếu tố yếu tố dịch tễ khác cần lựa chọn kháng sinh hợp lý và tiến hành điều trị kịp thời cho bệnh nhân. Đây là phương pháp đơn giản, nhanh, ít tốn kém [2]. Hơn nữa, kết quả thường được thông báo sau khi gửi bệnh phẩm khoảng 30 phút đến 1h [59]. Do vậy, kết quả dương tính
càng quan trọng và có ý nghĩa. Kể cả tuyến trung ương và tuyến cơ sở, khi chẩn đoán nghi ngờ giữa viêm màng não mủ với các loại viêm màng não khác thái độ lựa chọn tốt nhất là điều trị theo hướng viêm màng não mủ [21]. Nên kết quả nhuộm soi trực tiếp dương tính càng củng cố thêm việc lựa chọn phương pháp điều trị kịp thời cho bệnh nhân qua cơn nguy kịch.
Tuy nhiên phương pháp nhuộm soi trực tiếp có nhiều điểm hạn chế. Phương pháp chỉ phát hiện những bệnh phẩm mà số lượng vi sinh vật nhiều hoặc bệnh phẩm có số lượng vi sinh vật ít nhưng phải được ly tâm bằng máy ly tâm tế bào mới phát hiện. Những bệnh phẩm từ bệnh nhân đã dùng kháng sinh ở tuyến dưới hay những bệnh phẩm bảo quản và vận chuyển quá thời gian quy định phương pháp rất khó phát hiện.
Trong nghiên cứu của chúng tôi đã phát hiện được 95 trường hợp trong tổng số 3110 bệnh phẩm nuôi cấy. Trong đó, chúng tôi đã phát hiện:
- 71 trường hợp là vi khuẩn Gram dương - 12 trường hợp là vi khuẩn Gram âm - 12 trường hợp là nấm
Kết quả nhuộm soi ban đầu của chúng tôi cho thấy, nhóm căn nguyên vi khuẩn Gram dương chiếm tỷ lệ 74,6%. Nhóm vi khuẩn này chiếm ưu thế hơn hẳn so với hai nhóm căn nguyên vi khuẩn Gram âm và nấm. Dựa trên kết quả nhuộm soi này cho phép dự báo khuynh hướng căn nguyên gây bệnh viêm màng não gần đây. Giúp các bác sỹ lâm sàng lựa chọn kháng sinh phủ đầu hợp lý và kịp thời cho bệnh nhân. Tuy nhiên kết quả này cũng chỉ gợi ý dùng kháng sinh điều trị theo nhóm Gram âm hay Gram dương không cho phép làm kháng sinh đồ thử độ nhạy cảm của kháng sinh. Vì vậy vừa điều trị vừa chờ kết quả nuôi cấy và kháng sinh đồ sẽ rất hữu ích đối với các trường hợp điều trị kháng sinh phủ đầu thất bại.
3.1.3 Kết quả nuôi cấy dƣơng tính (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.3. Tỷ lệ nuôi cấy dương tính
Năm xét nghiệm Tổng số Dƣơng tính n % 2008 835 49 5,9 2009 995 65 6,5 2010 1280 78 6,1 Tổng cộng 3110 192 6,2
Trong 3110 bệnh phẩm dịch não tủy được nuôi cấy, chúng tôi đã phân lập được 192 chủng vi khuẩn và nấm, với 127 chủng cầu khuẩn Gram dương, 33 chủng trực khuẩn Gram âm, 29 chủng nấm, 3 chủng trực khuẩn Gram dương. Tỷ lệ dương tính 6,2%.
So sánh với các nghiên cứu khác trên thế giới về tỷ lệ dương tính, thì hầu hết các báo cáo không đề cập tới. Các báo cáo thường công bố số ca bệnh dương tính trong thời gian nghiên cứu. Theo nghiên cứu M H Tsai và cộng sự, có 329 trường hợp dương tính trong thời gian nghiên cứu 18 năm [62]. So
sánh với kết quả nghiên cứu tại miền bắc Ấn Độ trong thời gian nghiên cứu 8 năm từ 6/2001 đến 2/2009, nuôi cấy 5,859 bệnh phẩm dịch não tủy, 403 bệnh nhân dương tính vi khuẩn [45]. Như vậy, số lượng chủng phân lập trong dịch não tủy ở hầu hết các nghiên cứu đều không cao. Tỷ lệ dương tính của chúng tôi trong thời gian nghiên cứu 3 năm dao động từ 5,9% (2008) đến 6,5% (2009). Tính chung cho 3 năm là 6,2% với số lượng chủng là 192 cao hơn 1 số nghiên cứu tại Ấn Độ và 1 số nước ở trên.
Như vậy, tỷ lệ dương tính cao hay thấp phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó các yếu tố sau đây có ý nghĩa quan trọng: bệnh nhân đến sớm hay muộn, đã được hay chưa dùng kháng sinh. Bên cạnh đó, thời gian và cách bảo quản bệnh phẩm cũng rất quan trọng. Nếu bệnh phẩm bảo quản lạnh sẽ ảnh hưởng đến sức sống của vi sinh vật hoặc bệnh phẩm để quá lâu không được vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm hoặc vận chuyển bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm nhưng chậm trễ trong khâu xử lý sẽ gây hiện tượng âm tính giả. Cũng cần lưu ý các trường hợp dương tính giả có thể do bệnh phẩm nhiễm bẩn hoặc nuôi cấy từ hệ vi sinh vật của da [59]. Chất lượng và kinh nghiệm của phòng xét nghiệm cũng liên quan chặt chẽ đến kết quả xét nghiệm. Ngoài ra, nghiên cứu của chúng tôi mới dừng lại ở nuôi cấy tìm các căn nguyên ưa khí, ưa/kỵ khí tủy tiện và nấm, còn các căn nguyên kỵ khí vẫn chưa được tiến hành. Do đó phần nào hạn chế tỷ lệ nuôi cấy dương tính. Một phần nữa, có thể do chỉ định rộng rãi của bác sỹ lâm sàng gây ảnh hưởng đến tỷ lệ nuôi cấy dương tính.
3.1.4 Kết quả phân lập theo độ đục DNT
Bảng 3.4: Tỷ lệ phân lập dương tính theo độ đục DNT
Số lƣợng
Màu sắc n
Dƣơng tính
Số lƣợng %
Lẫn máu 128 3 2,3
Vàng chanh 6 0 0
Trong 2671 29 1,1
Sau khi đã có kết quả nuôi cấy, chúng tôi tiến hành đối chiếu tỷ lệ nuôi cấy dương tính theo phân loại độ đục dịch não tủy ban đầu và có một số bàn luận như sau: Trong 305 dịch não tủy đục như nước vo gạo hoặc lờ đục, chúng tôi đã phân lập được 160 chủng vi khuẩn và nấm với tỷ lệ dương tính là 52,5% từ bệnh phẩm này. Cụ thể bao gồm 139 chủng vi khuẩn và 21 chủng nấm. Thông báo của chúng tôi phù hợp với các tài liệu đã khẳng định: đối với dịch não tủy đục thường viêm mãng não do vi khuẩn [1], [16]. Đưa ra thông báo về tỷ lệ dương tính theo độ đục của dịch não tủy thường không thấy đề cập trong các tài liệu trong nước cũng như nước ngoài. Do vậy đưa được thông báo về tỷ lệ cụ thể của chúng tôi có giá trị thực tiễn trong chỉ định lâm sàng cũng như xét nghiệm. Từ tỷ lệ dương tính trên cho thấy, cứ 1,9 bệnh phẩm dịch não tủy đục được gửi tới nuôi cấy thì dương tính một trường hợp. Tỷ lệ dương tính tới 52,5% rất cao so với 6,2% dương tính trong thời gian nghiên cứu 3 năm. Rõ ràng sự chỉ định rộng rãi từ bác sỹ lâm sàng rất ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy dương tính cũng như tổn thất về mặt kinh tế cho bệnh nhân.
Từ 128 bệnh phẩm dịch não tủy lẫn máu chúng tôi cũng phân lập được 3 chủng vi khuẩn chiếm tỷ lệ 2,3%. Kết quả dương tính này có thể do viêm màng não mủ có xuất huyết màng não hoặc có thể do lỗi kỹ thuật khi chọc dò dịch não tủy [16] hoặc dịch não tủy lờ đục nhưng lẫn máu nên chúng tôi
Đối với dịch não tủy màu vàng chanh, chúng tôi không phân lập được chủng vi khuẩn nào. Có thể hiện tại chúng tôi chưa triển khai được kỹ thuật cấy tìm vi khuẩn lao tại phòng xét nghiệm.
Chúng tôi cũng phân lập được 29 chủng vi khuẩn và nấm từ bệnh phẩm dịch não tủy trong. Kết qủa này, có thể bệnh đang ở giai đoạn sớm hoặc màu sắc đục nhẹ nên không quan sát chính xác được hoặc do bệnh nhân đã dùng kháng sinh phủ đầu, lượng vi khuẩn giảm trong dịch não tủy. Đối với bệnh phẩm này thường được nghĩ đến căn nguyên virus do vậy tỷ lệ dương tính rất thấp, chỉ chiếm 1,1%.
3.1.5 Kết quả phân lập theo nhóm vi sinh vật gây bệnh
Bảng 3.5: Tỷ lệ phân lập theo nhóm vi sinh vật gây bệnh
Căn nguyên n %
Vi khuẩn 163 84,9
Nấm 29 15,1
Tổng 192 100
Chúng tôi đã phân lập được 2 nhóm căn nguyên gây viêm màng não trong nghiên cứu đó là vi khuẩn và nấm. Kết quả cho thấy, có tới 84,9% nguyên nhân gây viêm màng não là do vi khuẩn, cao hơn rất nhiều so với tỷ lệ 15,1 % do với căn nguyên nấm. Mặc dù có sự khác biệt như vậy nhưng có thể