2.3.1 Môi trƣờng nuôi cấy, phân lập vi khuẩn và nấm gây bệnh
- Thạch máu (Biorad - Mỹ) - Thạch Socola (Biorad - Mỹ) - Uri Select 4 (Biorad - Mỹ)
- Thạch thường (Biorad - Mỹ) - Canh thang BHI
Môi trường nuôi cấy nấm
- Sabouraud (Biorad - Mỹ)
2.3.2 Vật liệu – trang thiết bị định danh
Trang thiết bị định danh vi khuẩn và nấm
- Máy định danh tự động Phoenix
Vật liệu định danh vi khuẩn
- API Strep (BioMerieux - Pháp) để định danh các loài liên cầu
- API 20 E (BioMerieux - Pháp) để định danh các loài vi khuẩn Gram âm thuộc họ VK đường ruột
- API 20 NE (BioMerieux - Pháp) để định danh các loài vi khuẩn Gram âm không thuộc họ VK đường ruột
- API Staph (BioMerieux - Pháp) để định danh các loài cầu khuẩn Gram dương
- API Coryne (BioMerieux - Pháp) để định danh các loài trực khuẩn Gram dương
Vật liệu định danh nấm
- API 20C AUX của hãng Bio – Merieux (Pháp) để xác định các loài nấm Candida
- Phần mềm đọc API
2.3.3 Vật liệu và sinh phẩm làm kháng sinh đồ
- Thạch Muller – Hinton (Biorad – Mỹ)
- Thạch Muller – Hinton (Biorad – Mỹ) + 5% máu cừu - Nước muối sinh lý 0,85%
- Tăm bông vô trùng
- Độ đục chuẩn Mc Farland 0.5 - Máy đo độ đục chuẩn (BD – Mỹ) - Máy lắc Vortex
- Khoanh giấy kháng sinh (Biorad - Mỹ) - Phần mềm Whonet 5.4
- Các chủng quốc tế kiểm tra chất lượng + E.coli ATCC 25922
+ S.aureus ATCC 25923 + P.aeruginosa ATCC 27853
- Băng giấy E-test penicillin G có dải nồng độ từ 0,002 -32 µg/ml (Biodisk – Thụy Điển)
2.3.4 Các dụng cụ, hóa chất khác
- Lam kính, lá kính
- Bộ thuốc nhuộm Gram - Thuốc thử oxydase
- Khoanh giấy optochin xác định phế cầu - Huyết thanh thỏ xác định men coagulase - Mực tàu
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu [24]
- Nghiên cứu mô tả cắt ngang
- Quy trình tiến hành: xét nghiệm các trường hợp có chỉ định nuôi cấy của bệnh nhân vào điều trị tại các khoa lâm sàng tại Bệnh viện Bạch Mai trong thời gian nghiên cứu
2.4.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu
Tất cả bệnh nhân được bác sỹ chẩn đoán viêm màng não, có yêu cầu xét nghiệm nuôi cấy dịch não tủy.
- Dịch não tủy sau khi được chọc hút với thể tích 1- 2ml phải gửi ngay bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm. Bệnh phẩm không để quá 2h, luôn giữ ở nhiệt độ 35 - 370
C.
2.4.2 Tiêu chuẩn loại trừ
- Trả lại các mẫu bệnh phẩm để quá 2h hoặc bệnh phẩm bảo quản trong tủ lạnh trước khi gửi phòng xét nghiệm
SƠ ĐỒ NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP VI KHUẨN VÀ NẤM GÂY BỆNH TỪ DỊCH NÃO TỦY Đục Nuôi cấy Bệnh phẩm Nhận định màu sắc và thể tích dịch não tủy Nhuộm Gram Tiêu bản mực tàu Tế bào nấm men Vi khuẩn
(dương tính hoặc âm tính) DNT ≥ 1ml hoặc < 1ml DNT ≥ 2ml Mực tàu (-) Mực tàu (+)
2.4.3 Kỹ thuật nuôi cấy và phân lập vi khuẩn [14], [18], [22], [43], [59], [91] [91]
2.4.3.1 Xử lý bệnh phẩm
Quan sát thể tích và màu sắc dịch não tuỷ: độ trong, đục, có lẫn máu…
Soi trực tiếp
- Dùng pipet vô trùng hút dịch ở đáy ống bệnh phẩm
- Nhỏ 1-2 giọt lên lam kính, để nguyên giọt và làm khô bằng máy sấy lam.
- Tiến hành nhuộm Gram
Trên tiêu bản nhuộm Gram: phát hiện bất cứ loại vi khuẩn nào đều được coi là tác nhân gây bệnh
2.4.3.2 Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
35-370C
Nuôi cấy và phân lập các loại vi khuẩn trong dịch não tủy theo các bước sau:
Tiến hành nuôi cấy ngay sau khi nhận được bệnh phẩm.
- Sử dụng pipet vô trùng hút dịch ở đáy ống bệnh phẩm. Nhỏ 2-3 giọt lên môi trường thạch máu và socola. Cấy phân vùng bằng que cấy vô trùng trên mỗi đĩa.
- Nếu thể tích dịch não tủy chỉ hơn 1ml, bệnh phẩm từ não thất hoặc ống thông thì hút 1ml dịch não tủy vào canh thang nuôi cấy.
- Nếu lượng bê ̣nh phẩm chỉ khoảng 1-5 giọt
Sử dụng pipet Pasteur vô trùng hút 1 giọt lên lam kính để nhuô ̣m Gram.
Bổ sung 0,5ml canh thang vào ống bệnh phẩm. Đậy nắp, trô ̣n đều.
- Ủ ấm môi trường đĩa thạch máu và thạch socola ở 350
- 370 C với khí trường 5-10% CO2/24h
- Ủ ấm canh thang ở 350
C-370C/24h trong tủ ấm thường.
Diễn giải kết quả nuôi cấy
- Kiểm tra tất cả đĩa nuôi cấy và canh thang BHI sau 24h. Nếu không xuất hiện khuẩn lạc và canh thang không đục thì tiếp tục ủ ấm.
- Đọc các đĩa nuôi cấy hằng ngày trong vòng 4 ngày.
- Nếu kết quả nhuộm Gram dương tính, không xuất hiện khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy hoặc có yêu cầu cấy nấm phải giữ đĩa ít nhất trong vòng 1 tuần
- Kiểm tra môi trường canh thang trong vòng 4 ngày và loại bỏ nếu canh thang trong sau 7 ngày.
- Nếu có khuẩn lạc sau nuôi cấy, thông báo ngay cho bác sỹ kết quả nuôi cấy sơ bộ dương tính và tiến hành định danh loài vi khuẩn phân lập được.
- Nếu môi trường canh thang đục cấy chuyển 2 môi trường thạch máu và thạch socola. Rồi tiếp tục định danh vi khuẩn theo quy trình
2.4.4 Kỹ thuật định danh vi khuẩn
Định danh các loài Streptococci + Streptococcus nhóm viridans (α):
- Nhuộm Gram: hình ảnh cầu khuẩn Gram dương xếp chuỗi hoặc xếp đôi, kích thước 0,6-1µm
- Trên môi trường thạch máu cừu: khuẩn lạc trong, có vòng tan máu α
- Không di động - Catalase (-)
- Esculin (-) hoặc (+)
- Xác định tính chất sinh vật học bằng API 20 Strep hoặc máy định danh tự động Phoenix.
- Nhuộm Gram: hình ảnh cầu khuẩn Gram dương thường xếp chuỗi hoặc xếp đôi, kích thước 0,6-1µm .
- Trên môi trường thạch máu, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, màu hơi xám, có vòng tan máu hoàn toàn β - Catalase (-)
- Không di động - VP (-)
- Barcitracin (+) đối với liên cầu nhóm A
- Xác định kháng nguyên bằng thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh liên cầu để xác định nhóm A, B, C, D, G - Xác định tính chất sinh vật học bằng API 20 Strep hoặc máy
định danh tự động Phoenix.
Staphylococci
- Nhuộm Gram: Hình ảnh cầu khuẩn Gram dương xếp bốn hoặc xếp đám hình chùm nho, kích thước 0,8-1,0 µm.
- S. aureus
+ Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc tròn, ướt, bóng, có sắc tố vàng, có vòng tan máu hoàn toàn.
+ Catalase (+) + Coagulase (+)
+ Lên men đường mannitol + Tan máu β
+ Catalase (+) + Coagulase (-)
+ Không lên men đường mannit + Không tan máu β
+ Xác định tính chất sinh vật học bằng API Staph hoặc máy định danh tự động Phoenix.
Streptococcus pneumoniae
- Nhuộm Gram: Hình ảnh song cầu Gram dương hình ngọn nến, thường xếp thành đôi, ít khi đứng riêng lẻ, đường kính khoảng 0,5- 1,25µm.
- Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc tròn, bóng, trong như giọt sương, xung quanh có có vòng tan máu α
- Optochin (+) đường kính vòng vô khuẩn >14mm - Catalase (-)
- Bị ly giải bởi muối mật
- Xác định tính chất sinh vật học bằng API Strep hoặc máy định danh tự động Phoenix.
Enterococci:
- Nhuộm Gram: Hình ảnh cầu khuẩn Gram (+), xếp thành đôi hoặc chuỗi ngắn.
- Trên môi trường thạch máu khuẩn lạc nhỏ, bóng, xung quanh có vòng tan máu α hoặc γ. Một vài chủng E. faecalis có thể gây tan máu β trên môi thạch máu (máu thỏ, máu ngựa, máu người), nhưng không tan máu cừu
- Esculin (+)
- Catalase (-)
- Phát triển trong môi trường canh thang muối 6,5%
- Xác định tính chất sinh vật học bằng API 20 Strep hoặc máy định danh tự động Phoenix.
Enterobacteriaceae (họ vi khuẩn đường ruột)
- Nhuộm Gram: Hình ảnh trực khuẩn Gram âm, kích thước 2-4 µm x 0,4-0,6 µm.
- Trên môi trường đặc có ba dạng khuẩn lạc dạng S, R, M, đường kính 2-3 mm
- Oxydase (-)
- Lên men đường glucose - Không sinh nha bào
- Sinh hơi hoặc không sinh hơi khi lên men đường - Có thể di động hoặc không di động
- Xác định tính chất sinh vật học bằng API 20E hoặc máy định danh tự động Phoenix.
Pseudomonadaceae
- Nhuộm Gram: Hình ảnh trực khuẩn Gram âm, thẳng hoặc hơi cong - Di động (+) trừ Burkholderia mallei
- Hiếu khí
- Mọc trong khoảng nhiệt độ 4-430 C
- Catalase (+)
- Trên môi trường đặc, P. earuginosa có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: một loại to, nhẵn, bờ trải, giữa lồi; một loại khác thì xù xì; cũng có khi gặp loại thứ ba, khuẩn lạc nhày. Tính chất đặc trưng của trực khuẩn mủ xanh là sinh sắc tố và chất thơm.
- Xác định tính chất sinh vật học bằng API 20 NE hoặc máy định danh tự động Phoenix.
Acinetobacter
- Nhuộm Gram: Cầu trực khuẩn Gram âm, thường đứng ở dạng đôi hoặc chuỗi dài ngắn khác nhau.
- Trên môi trường thạch máu: khuẩn lạc lồi, nhẵn, đôi khi hơi nhày, màu hơi trắng xám. Đường kính khuẩn lạc A. baumannii từ 1-3mm, các Acinetobacter khác khuẩn lạc nhỏ hơn
- Không di động - Oxydase (-)
- Catalase (+)
- Citrate (-)
- Nitrate (-)
- Xác định tính chất sinh vật học bằng API 20NE hoặc máy định danh tự động Phoenix.
Nhuộm Gram: Hình ảnh tế bào nấm men hình bầu dục hoặc ovan trong dịch não tủy, tiếp tục làm thử nghiệm với tiêu bản mực tàu. Thử nghiệm mực tàu:
- Nguyên lý: Nhỏ bệnh phẩm lên giọt mực tàu làm cho hỗn hợp trở nên tối nhờ các hạt carbon trong mực. Vỏ của tế bào nấm sẽ nổi rõ trên nền mực tàu tạo thành vòng sáng bao quanh.
- Tiến hành
+ Nhỏ 1 giọt dịch não tủy lên lam kính sạch
+ Thêm một giọt mực tàu (bằng 1/3 bệnh phẩm) và trộn đều + Đậy lamen và soi dưới vật kính 40X
- Kết quả:
+ Cryptococcus: Tế bào nấm xuất hiện với một vòng sáng rõ nét bao quanh. Tế bào nấm men thường tròn. Chồi nấm có thể có hoặc chưa xuất hiện.
+ Candida: Tế bào nấm hình ovan, không có vòng sáng bao quanh Nuôi cấy và định danh
- Bệnh phẩm được nuôi cấy và ủ ấm 35-370C trên môi trường sabouraud có chứa kháng sinh chloramphenicol.
- Dựa vào chẩn đoán và kết qủa tiêu bản mực tàu trước khi nuôi cấy để định hướng và đánh giá khuẩn lạc.
- Khuẩn lạc trên môi trường Sabouraud thường xuất hiện trong 1 – 5 ngày. Ban đầu khuẩn lạc có màu trắng mềm đến nâu nhạt, sau đó có thể trở nên nhầy và màu kem đến nâu.
- Sử dụng API 20C AUX để kiểm tra tính chất sinh vật hóa học và khẳng định kết quả nuôi cấy.
2.5 Kỹ thuật kháng sinh đồ
2.5.1 Phƣơng pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán [5], [27], [38], [39]
Nguyên lý: Các loại kháng sinh khác nhau đã được tẩm trong các khoanh giấy sẽ khuyếch tán trong đĩa thạch và kìm hãm sự phát triển của chủng vi khuẩn trên bề mặt thạch. Dựa vào đường kính vòng ức chế để đánh giá mức độ nhạy cảm hay đề kháng của kháng sinh.
Các bước tiến hành
- Chủng vi khuẩn thuần nhất được cấy trên môi trường nuôi cấy khác nhau (thạch thường, thạch máu) tùy thuộc từng loại vi khuẩn trong 18-24h
- Pha huyền dịch bằng cách lấy 3 đến 5 vi khuẩn thuần pha vào dung dịch nước muối 0,85% và lắc đều bằng máy vortex, so độ đục chuẩn tương đương Mc Farland 0,5 (tương đương 1,5x108
- Dùng tăm bông vô trùng thấm ướt huyền dịch vừa pha (độ ẩm vừa phải), ria đều vi khuẩn lên mặt đĩa thạch Muleller - Hinton (là môi trường chuẩn để tiến hành kỹ thuật kháng sinh đồ)
- Đặt khoanh giấy kháng sinh vào đĩa bằng kim nhọn, khoảng cách các khoanh khoảng 20-25 mm và cách thành đĩa từ 10-15 mm
- Ủ ấm 35-370C/24h trong tủ ấm thường. Riêng phế cầu phải ủ trong tủ ấm có khí trường 5-10% C02
Nhận định kết quả:
- Đo đường kính vòng ức chế bằng thước đo milimet
- So sánh với bảng giới hạn dành cho chủng mẫu để kiểm tra chất lượng xét nghiệm. Chỉ khi kết quả chủng mẫu đạt yêu cầu mới đọc kết quả trên chủng phân lập từ bệnh nhân
- Đánh giá mức độ nhạy cảm của KS ở 3 mức độ + Nhạy cảm (susceptible): S
+ Trung gian (intermediate): I + Đề kháng (resistant): R
Phiên giải kết quả theo hướng dẫn của CLSI
2.5.2 Phương pháp E-test [39], [44], [59]
Nguyên lý: Sử dụng thanh giấy chứa các nồng độ kháng sinh nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu sự phát triển của vi khuẩn
Tiến hành
- Để đĩa thạch và băng giấy chứa các nồng độ kháng sinh ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
- Lấy 4 hoặc 5 khuẩn lạc vào môi trường nước muối 0.9% và ủ ấm 350C trong 2-8h để đạt độ đục 0.5 Mc Farland
- Lắc đều bằng máy vortex, so độ đục chuẩn tương đương 0.5 Mc Farland (1.5 x 108 CFU/ml).
Bước 2: Ria huyền dịch và đặt băng giấy
- Nhúng tăm bông vào ống đựng huyền dịch, ép nhẹ lên thành ống rồi ria toàn bộ lên mặt thạch.
- Dùng panh đặt băng giấy E-test lên mặt thạch
- Đặt băng giấy lên trên mặt thạch với nồng độ kháng sinh cao nhất ở gần cạnh của đĩa petri. Đối với đĩa có đường kính 90mm, có thể đặt 1 hoặc 2 băng giấy
- Loại bỏ các bóng khí của băng giấy trên mặt thạch bằng cách dùng panh ấn nhẹ nhàng lên băng giấy.
- Không thay đổi vị trí của băng giấy E-test sau khi đã đặt trên mặt thạch. Nếu đặt ngược băng giấy có thể dùng panh lật nhẹ nhàng và đặt lại.
Bước 3: Ủ ấm
- Lật ngược đĩa thạch và ủ ấm 16-20h ở 350C (không chồng quá 5 đĩa trong tủ ấm)
Bước 4: Đọc và diễn giải kết quả
- Mở nắp và đọc đĩa nơi có nguồn sáng.
- Giá trị MIC được đọc dựa vào điểm tiếp xúc giữa vòng ức chế vi khuẩn (hình elip) với điểm tiếp xúc thấp nhất của băng giấy E-test trên mặt thạch.
+ Nhận định kết quả MIC bằng E-test Penicillin với S. suis theo tiêu chuẩn của viện nghiên cứu tiêu chuẩn hóa lâm sàng và xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI)
+ Nhạy cảm: MIC ≤ 0,12 µg/ml + Trung gian: MIC = 0,23-2 µg/ml + Đề kháng: MIC ≥ 4 µg/ml
2.6 Xử lý số liệu
- Các số liệu được thu thập và phân tích bằng phần mềm Whonet 5.4 - Các số liệu được xử lý trên phần mềm thống kê SPSS 11.5
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả nuôi cấy dịch não tủy
Trong thời gian nghiên cứu từ năm 2008 đến 2010, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy 3110 mẫu bệnh phẩm DNT
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi như sau:
3.1.1 Phân bố độ đục dịch não tủy
Bảng 3.1: Phân bố độ đục dịch não tủy
Số lƣợng Độ đục n Tỷ lệ % Đục 305 9,8 Lẫn máu 128 4,1 Vàng chanh 6 0,2 Trong 2671 85,9 Tổng cộng 3110 100
Theo nhận định độ đục dịch não tủy, tỷ lệ dịch não tủy trong chiếm 85,9%, sau đó đến dịch não tủy đục chiếm 9,8%. Dịch não tủy lẫn máu là 4,1% và vàng chanh là 0,2%.
Nhận định độ đục dịch não tủy rất có ý nghĩa trong chẩn đoán sơ bộ căn nguyên gây viêm màng não. Đây là bước cần thiết và quan trọng không chỉ