2.3.4.1. Nhân dòng trực tiếp đoa ̣n gen mã hóa VP28 vào vector
Các sản phẩm của phản ứng PCR nhân bản đoạn gen vp28 từ các mẫu tôm nhiễm bệnh đốm trắng, sau khi đã kiểm tra trên gel agarose 2%, đƣợc gắn trực tiếp vào vector nhân dòng pGEM-T theo kit của Promega. Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm vào vector đầu T trên tổng thể tích 10 l nhƣ sau: 2 l sản phẩm PCR, 1 l đệm T4 DNA ligase 10X, 1 l T4 DNA ligase, 1 l vector đầu T, 5 l ddH2O. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 22oC trong 2-3 giờ hoặc 4 oC qua đêm và giữ ở -20oC cho đến khi biến nạp.
61
Tế bào khả biến E. coli chủng DH5 hoặc BL21 (bảo quản ở -80oC) đƣợc lấy ra để trên đá 10-20 phút cho tan dần. Hỗn hợp phản ứng gắn ở trên đƣợc bổ sung vào, trộn nhẹ và để trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào, sau đó đƣợc sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây và đƣợc chuyển ngay lên đá 2 phút. 300-500 l môi trƣờng LB lỏng đƣợc bổ sung vào hỗn hợp biến nạp. Mẫu sau đó đƣợc giữ trong tủ ấm 37oC trong 10 phút và lắc ở tốc độ 150 vòng/phút, 37o
C trong 50 phút. 50-100 l hỗn hợp biến nạp đƣợc cấy trải tế bào trên đĩa petri chứa môi trƣờng LB đặc có 50 g/ml ampicillin, 20 l X-gal 20 mg/ml và 20 l IPTG 100 mM và nuôi trong tủ ấm 37oC qua đêm.
2.3.4.2. Giải trình tự gen
Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hoá cho VP28 đƣợc pha loãng ở nồng độ thích hợp (khoảng 50-100 pmol) đƣợc dùng làm khuôn cho PCR trong xác định trình tự. Thành phần PCR cho xác định trình tự gồm: 6 l hỗn hợp DTCS (Dye terminator cycle sequencing) Master mix, 1 l khuôn, 1 l mồi, H2O vô trùng vừa đủ 20 l. Về cơ bản, PCR này có các thành phần giống nhƣ PCR thông thƣờng nhƣng có một số khác biệt là thêm sự có mặt của các ddNTP và chỉ cần dùng một loại mồi (mồi xuôi hoặc mồi ngƣợc). PCR đƣợc thực hiện nhƣ sau: 96o
C trong 1 phút để khởi động nóng tiếp theo là 35 chu kỳ gồm 3 bƣớc: 96oC trong 30 giây để làm biến tính DNA, 56oC trong 30 giây để gắn mồi, 60oC trong 4 phút để kéo dài chuỗi. Mẫu sau đó đƣợc ủ tiếp ở 60oC trong 7 phút và giữ ở 4oC cho đến khi phân tích.
Sản phẩm PCR này đƣợc tiếp tục xử lý trƣớc khi đƣa vào máy đọc trình tự. Quá trình xử lý mẫu gồm các bƣớc sau:
- Dung dịch dừng phản ứng (stop solution) đƣợc chuẩn bị ngay trƣớc khi dùng bao gồm: 20 l K-acetate 3 M, pH 5,2; 20 l EDTA 100 mM pH 8; 10 l glycogen và trộn đều. 5 l dung dịch dừng phản ứng đƣợc bổ sung vào mỗi ống sản phẩm PCR 20 l.
62
- 60 l ethanol 95% giữ ở -20oC đƣợc bổ sung vào hỗn hợp và trộn kỹ. Sau đó, hỗn hợp phản ứng đƣợc ly tâm ngay ở 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC. Dịch nổi đƣợc hút bỏ và thu kết tủa. Kết tủa đƣợc rửa 2 lần, mỗi lần bằng 200 l ethanol 70% giữ ở -20oC và đƣợc ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch nổi đƣợc hút bỏ, thu kết tủa và đƣợc để khô ở nhiệt độ phòng. Kết tủa đƣợc hoà tan trở lại bằng 40 l dung dịch SLS (sample loading solution). Mẫu sau khi xử lý đƣợc giải trình tự bằng hệ thống đọc trình tự.
2.3.4.3. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa VP28
Vector nhân dòng (pGEM T) tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa cho VP28 đƣợc xử lý với cặp enzyme giới hạn có trình tự cắt đã thiết kế thêm trên các cặp mồi để thu đƣợc đoạn gen mã hóa VP28 và cũng để tạo đầu tƣơng thích ở hai đầu đoạn gen. Đồng thời, vector biểu hiện cũng đƣợc xử lý cùng bằng cặp enzyme giới hạn với vector nhân dòng để tạo đầu dính tƣơng thích. Thành phần phản ứng cắt giới hạn bao gồm: 6 l đệm II 10X, 30 l vector, 2 l enzyme giới hạn, bổ sung dd H2O cho đủ 60 l.
Hỗn hợp phản ứng sau khi đƣợc hòa tan theo đúng tỉ lệ sẽ đƣợc ủ ở 37o
C qua đêm, tạo sản phẩm cắt hoàn toàn.
Sau khi cắt bằng enzyme giới hạn, đoạn gen mã hóa VP28 và đoạn vector biểu hiện dạng mạch hở đƣợc tinh sạch (bằng kit thôi gel của Bioneer). Theo quy trình này trƣớc tiên, sản phẩm cắt enzyme giới hạn cần đƣợc chạy trên gel agarose 1% để phân tách các băng. Sau đó, băng DNA khoảng 615 bp của đoạn gen mã hóa VP28 và vector biểu hiện dạng mạch hở với kích thƣớc phù hợp đƣợc thu nhận lại. 5 lần thể tích đệm GB (Gel Binding Buffer) đƣợc bổ sung vào 1 thể tích đoạn gel đã cắt. Hỗn hợp đệm và gel sau đó đƣợc đun ở 600C trong khoảng 10-15 phút để gel tan hết. Sau khi gel tan hoàn toàn, hỗn hợp phản ứng đƣợc đƣa lên cột thôi gel, cột sau đó đƣợc ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút, 4oC. Cột đƣợc rửa 2 lần bằng 500 l đệm rửa WB (Wash Buffer). Sau đó, DNA gắn trên cột đƣợc thu lại bằng cách bổ sung 30-60 l đệm rƣ̉a chiết EL (Elute Buffer). Cột đƣợc ly tâm ở
63
13.000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. DNA trong dịch ly tâm đƣợc thu nhận và giữ ở -20oC cho đến khi sử dụng.
Sau khi tinh sạch, đoạn gen mã hóa VP28 và vector biểu hiện đƣợc gắn với nhau nhờ enzyme nối T4 DNA ligase theo tỷ lệ đoạn gen và vector là 3:1, tổng thể tích phản ứng gắn 10-20 l. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 4oC qua đêm và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5. Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa thạch đƣợc sàng lọc bằng PCR trực tiếp, sau đó khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc lựa chọn để tách plasmid tái tổ hợp.
2.3.4.4. Dung hợp đoạn gen đích vào DNA hệ gen của B. subtilis chủng PY79 Thí nghiệm d ung hợp đoạn gen đích vào DNA hệ gen của B. subtilis chủng PY79 đƣợc thƣ̣c hiê ̣n nhƣ Harwood và tập thể mô tả trong [36]. Tế bào khả biến B. subtilis PY79 (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80oC) đƣợc lấy ra, giữ ở nhiệt độ phòng cho đến khi tan hoàn toàn. Ngay sau khi tế bào đƣơ ̣c giải đông, 2-4 μl DNA (vector pDG364-cotB-vp28 hoặc vector pDG364-cotB-gst-vp28 đã đƣợc tạo dạng mạch thẳng) đƣợc bổ sung vào ống, nuôi lắc ở 37o
C trong 30-45 phút. Một đối chứng âm đƣợc tiến hành song song cùng với mẫu trong đó DNA đƣợc thay thế bằng nƣớc đã khử trùng. Bƣớc tiếp theo, tế bào biến nạp đƣợc cấy trải lên đĩa chứa môi trƣờng thạch DSM có chọn lọc bằng chloramphenicol nồng độ 5 μg/ml, ủ ở 37oC qua đêm.
Sau quá trình biến nạp, các khuẩn lạc thu đƣợc sẽ đƣợc cấy chuyển sang đĩa môi trƣờng LB có bổ sung 1% tinh bột và nuôi ở 37oC qua đêm.
Về mặt lý thuyết, đoạn DNA đích gắn đƣợc vào hệ gen của B. subtilis nhờ quá trình trao đổi chéo giữa các đoạn tƣơng đồng,ở đây là đoạn amyE front và amyE back trên vector với trình tự amyE có trên DNA hệ gen của B. subtilis. Vì đoạn gen dung hợp nằm kẹp giữa 2 trình tự amyE front và amyE back của vector, nên đoạn gen dung hợp này sẽ chèn vào chính vị trí amyE của B. subtilis. Do vậy, B. subtilis
mang đoạn gen dung hợp cotB-VP28 sẽ mất khả năng sinh amylase. Đây cũng chính là cơ chế để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen dung hợp trong genome của B. subtilis. Các khuẩn lạc sẽ đƣợc chọn ngẫu nhiên và nuôi trên môi trƣờng LB có bổ sung 1% tinh bột. Kết quả là, khi kiểm tra bằng phƣơng pháp nhuộm màu iot
64
(I2/KI) đĩa nuôi cấy, khuẩn lạc nào tạo vòng phân giải tinh bột do amylase vẫn đƣợc sinh ra sẽ không mang đoạn gen đích, khuẩn lạc nào không có vòng sáng có nghĩa là đoạn gen dung hợp đã chèn vào DNA hệ gen thành công. Các khuẩn lạc không còn hoạt tính amylase này đƣợc chọn nuôi, chuẩn bị cho bƣớc kiểm tra biểu hiện tiếp theo.
2.3.5. Phát hiện, định lƣợng và tinh sạch VP28
2.3.5.1 Thu dịch chiết
Tế bào E. coli BL21RIL có chứa vector biểu hiện tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa VP28 đƣợc nuôi cấy khởi động trong 4 ml môi trƣờng LB lỏng có chứa kanamycin 50 g/ml và chloramphenicol 34 g/ml trong 14-16 giờ. Môi trƣờng nuôi cấy sau đó đƣợc trẻ hóa trong 100 ml LB lỏng và tiếp tục đƣợc nuôi cấy tới khi A600 đạt 0,7-0,8. IPTG đƣợc bổ sung đạt nồng độ cuối cùng 0,1 mM để cảm ứng sinh tổng hợp protein đích. Sau 3 giờ nuôi cấy, tế bào đƣợc thu lại bằng cách ly tâm dịch ở 6.000 vòng/phút trong 10 phút, 4oC và sinh khối tế bào đƣợc hòa lại trong 3 ml đệm A (Tris HCl 20 mM, pH 7,9, NaCl 100 mM, PMSF 1 mM, imidazol 5 mM). Tế bào đƣợc phá vỡ bằng siêu âm 4 lần, mỗi lần 30 giây. Hỗn hợp siêu âm đƣợc ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút, 4oC để thu dịch chiết tế bào chứa protein. Phần tủa tế bào sau đó đƣợc hòa tan bằng 3 ml đệm A có urea 8 M, không có PMSF và đƣợc lắc trong 30 - 60 phút để hòa tan hoàn toàn các protein trong phân đoạn tủa.
Dịch chiết protein áo bào tử đƣợc thu nhƣ sau:
Với mỗi ống bào tử thu đƣợc, 40 μl dung dịch đệm chiết (extraction buffer) đƣợc bổ sung vào. Thành phần dung dịch đệm chiết nhƣ sau:
- Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 : 1 ml
- SDS 10% : 1 ml
- DTT (β-mercaptoethanol) 1M : 0,5 ml - H2O khử trùng vừa đủ : 10 ml
Sau khi bổ sung dung dịch đệm chiết, các ống đƣợc trộn đều và ủ ở 95oC trong 15 phút (sau 5 phút mỗi ống đƣợc lấy ra và lắc mạnh). Cuối cùng, các ống
65
đƣợc ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 10 phút, thu lại dịch nổi để kiểm tra sự có mặt của protein dung hợp bằng phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch.
2.3.5.2. Định lƣợng protein bằng các đo độ hấp thụ ở 280 nm (A280) và bằng phƣơng pháp của Bradford [12 ]
Dựa vào sự hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 280 nm (A280) của các protein. Tại bƣớc sóng này các acid amin có nhân thơm của protein có độ hấp thụ cực đại. Từ giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 280 nm của các mẫu, sử dụng protein albumin huyết thanh bò (BSA) làm chuẩn với hệ số A280 = 0,66 tƣơng đƣơng với 1 mg/ml để tính ra lƣợng protein có trong mẫu.
Dung dịch protein VP28 của WSSV sau khi đƣợc pha loãng thành các nồng độ khác nhau trong đệm mẫu tƣơng ứng và đƣợc giá tri ̣ A280 bằng quang phổ kế.
Bên cạnh định lƣợng protein bằng cách đo A280, việc định lƣợng protein còn đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp Bradford.
Phƣơng pháp Bradford xác định hàm lƣợng protein dựa vào liên kết giữa coomassie brilliant blue G-250 (CBB) với protein tạo nên phức chất màu xanh có khả năng hấp thụ ánh sáng cực đại ở 595 nm. Cƣờng độ màu phản ánh hàm lƣợng protein trong dung dịch.
800 l dung dịch mẫu có chứa từ 2-10 µg protein đƣợc cho vào ống nghiệm, sau đó 200 µl dung dịch thuốc thử Bradford đƣợc bổ sung và lắc đều. A595 đƣợc đo sau 3 phút nhƣng trƣớc một giờ, từ giá trị A595 đo đƣợc, so với đƣờng chuẩn (sử dụng albumin huyết thanh bò có hàm lƣợng đã biết) đƣợc dựng theo cách tƣơng tự để tính ra hàm lƣợng protein trong mẫu nghiên cứu.
2.3.5.3. Tinh sạch protein dung hợp His-tag bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực qua cột His-bind
Sắc ký qua cột His-bind: gel His-bind (gel Nickel –agarose) đƣợc nhồi vào cột (kích thƣớc 10x1 cm) để có thể tích cột gel 2,5 - 3 ml. 15 ml NiCl2 50 mM đƣợc cho chảy qua với tốc độ 15-20 ml/giờ để đảm bảo sự bão hòa ion Ni2+ cho gel. Cột gel đƣợc cân bằng với đệm Tris - HCl 20 mM, pH 7,9, NaCl 100 mM, PMSF 1 mM, imidazol 5 mM (đệm A) bằng cách cho 15 ml đệm A chảy qua với tốc độ 20-
66
30 ml/giờ. VP28 đƣợc tinh sạch dƣới dạng không biến tính và biến tính. Sự khác nhau là trong điều kiện không biến tính và biến tính chỉ ở chỗ đệm sắc ký không chứa và có urea 8 M. Phân đoạn VP28 sau tinh sạch trong điều kiện biến tính đƣợc pha loãng về nồng độ khoảng 0,01 - 0,1 mg/ml và cho thẩm tích đổi đệm B (Tris- HCl 20 mM, pH 7,9 có NaCl 50 mM, DTT 1 mM, -mecaptoethanol (-ME) 1 mM, glycerol 5% với nồng độ urea giảm dần từ 8 M đến 0 M. Sau khi thẩm tích, mẫu đƣợc cô bằng centricon 3 kDa, tốc độ ly tâm 6.000 vòng/phút, ở 4oC đến khi hàm lƣợng protein đạt từ 0,1 đến 1 mg/ml; sản phẩm đƣợc bảo quản ở -80oC cho đến khi dùng.
2.3.5.4. Điện di protein trên gel polyacrylamide có SDS theo phƣơng pháp của Laemmli [53]
Gel polyacryamide chạy điện di gồm 2 lớp: lớp gel tách 15% và lớp gel cô 4%, với tỉ lệ thành phần đƣợc nêu ở bảng 2.3.
Bảng 2.4: Thành phần gel cô và gel tách acrylamide trong SDS-PAGE Thành phần Gel tách 15% Gel cô 4%
Dung dịch acrylamide 30% 1875 µl 163 µl 4x Tris - HCl/SDS pH 8,8 938 µl 4x Tris - HCl/SDS pH 6,8 313 µl Nƣớc cất 938 µl 763 µl APS 10% 30 µl 20 µl TEMED 7 µl 5 µl
Mẫu protein sau khi trộn với đệm mẫu (nồng độ 4x) theo tỷ lệ thể tích 3:1 đƣợc xử lý nhiệt ở 95oC trong 5 phút và làm lạnh ngay trên đá. Mẫu đƣợc tra vào giếng. Điện di trong đệm Tris-glycine pH 8,8 chứa SDS 1% với điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho tới khi vạch màu chỉ thị (bromophenol xanh) cách đáy bản gel 0,5 cm thì dừng lại. Bản gel điện di đƣợc nhuộm với dung dịch CBB 0,5% pha trong hỗn hợp methanol: acetic: nƣớc với tỉ lệ thể tích là 3:6:1 khoảng 20 phút. Tiến hành tẩy gel bằng hỗn hợp đã dùng để pha CBB cho tới khi bản gel có nền sáng.
67 2.3.5.5. Thẩm tách miễn di ̣ch
Dựa trên sự tƣơng tác đặc hiệu giữa VP28 (kháng nguyên) và kháng thể đơn dòng kháng VP28 (thƣơng mại) làm kháng thể sơ cấp, phức hợp VP28 và kháng thể tƣơng ứng này sau đó lại đƣợc nhận ra bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzyme phosphatase kiềm (AP), và cuối cùng phức hợp VP28 và kháng thể sơ cấp - kháng thể thứ cấp đƣợc phát hiện bằng cách cho ủ với dung dịch cơ chất, enzyme gắn trên kháng thể thứ cấp biến đổi cơ chất NBT và BCIP không màu thành sản phẩm có màu dễ dàng nhận ra bằng mắt thƣờng. Dịch chiết protein tổng số của vi khuẩn E. coli chứa pET28b-vp28 hoặc B. subtilis biểu hiện VP28 trên bề mặt sau khi đƣợc tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE, đƣợc chuyển lên màng PVDF (Polyvinylidene fluoride) bằng phƣơng pháp điện chuyển trong đệm Tris-Glycine có 10% methanol. Trong quá trình điện chuyển, vị trí các băng protein đƣợc giữ nguyên. Màng đƣợc cố định bằng dung dịch BSA 3% trong đệm PBS pH 7,4 qua đêm ở 4o
C hoặc bằng cách lắc nhẹ 30 phút đến 1 giờ ở nhiệt độ phòng, BSA thừa đƣợc rửa 3 lần bằng đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%. Màng sau đó đƣợc ủ với kháng thể sơ cấp trong nghiên cứu này là kháng thể đơn dòng kháng VP28, lắc nhẹ trong ít nhất 1 giờ, ở 37oC. Kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng đƣợc loại bỏ bằng cách tráng rửa màng 3 lần trong đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%. Sau đó màng đƣợc ủ với kháng thể thứ cấp trên chuột có gắn phosphatase kiềm. Kháng thể thứ cấp bám không đặc hiệu cũng đƣợc loại bỏ bằng cách tráng rửa màng trong đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%. Các băng protein đƣợc hiện màu bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất p- nitro blue tetrazolium chloride và 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP) pha trong đệm Tris-HCl 0,1 M, pH 9,5 có MgCl2 5 mM và NaCl 0,1 M. Phản ứng đƣợc làm ngừng trong đệm PBS 1x, pH 7,4 có chứa EDTA 20 mM khi các băng