subtilis
Gần đây plasmid (pDG364) đã đƣợc xây dựng bở i Stragier [36] để đƣa các gen quan tâm vào hê ̣ gen của B. subtillis thông qua trao đổi chéo tƣơng đồng ở vùng locus amyE. Những đặc nổi bật nhất của plasmid này là: có phần trƣớc và sau locus
amyE (amyE front và amyE back), gen cat chọn lọc CmR ở B. subtillis, bla (kháng ampicillin) và điểm khởi đầu sao chép ở E. coli, ba vị trí cắt giới hạn duy nhất (EcoRI, HindIII và BamHI) để nhân dòng đoạn DNA mong muốn, một vài vị trí cắt giới hạn để làm thẳng plasmid.
Plasmid pDG364-cotB, pDG364-cotB-gst đƣợc tạo thành từ plasmid pDG364 có gắn thêm gen cotB, cotB-gst ở vị trí enzyme giới hạn BamHI, HindIII. Việc dung hợp thêm protein GST (26 kDa) có thể làm tăng khả năng bộc lộ của protein ngoại lai trên bề mặt bào tử B. subtilis [56]. Dựa trên điều kiện sẵn có của
85
phòng thí nghiệm cùng với kinh nghiệm đã biểu hiện một protein khác ở vector pDG364, vector pDG364-cotB và pDG364-cotB-gst đã đƣơ ̣c lƣ̣a cho ̣n cho biểu hiện VP28 trên bề mặt bào tử B. subtilis. Khi gắn gen vp28 vào vector pDG364-cotB, pDG364-cotB-gst thông qua HindIII và EcoRI, tạo ra plasmid pDG364-cotB-vp28, pDG364-cotB-gst-vp28. Trong vector tái tổ hợp tạo đƣợc đã bao gồm những vùng promoter cotB (PcotB) và đoạn gen có kích thƣớc 825 bp, 1325 bp tƣơng ứng mã hóa cho cotB cải biến và cotB có gắn gst.
3.2.2.1. Dung hợp đoạn gen cotB-vp28, cotB-gst-vp28 vào hệ gen của B. subtilis
Vector tái tổ hợp đƣợc ký hiệu là pGEM - vp28 và đƣợc tách ra ở dạng tinh sạch đƣợc dùng làm khuôn cho PCR. Cặp mồi đặc hiệu của gen vp28 dùng để nhân dòng gen vp28 vào vector pDG364-cotB và pDG364-cotB-gst là VP28.3 Fw/Rv có đƣa vào các trình tự nhận biết enzyme giới hạn HindIII ở đầu Fw và EcoRI ở đầu Rv để thuận tiện cho các bƣớc nhân dòng về sau. Để đƣa đƣợc đoạn gen vp28 vào vector pDG364-cotB, pDG364-cotB-gst cả 3 vector pGEM-VP28, pDG364-cotB và pDG364-cotB-GST đều đƣợc xử lý bằng cặp enzyme giới hạn HindIII và EcoRI nhờ đó ta ̣o ra các đầu đính tƣơng thích với nhau, kết quả đã thu đƣợc nhƣ ở hình 3.8 cho thấy, vector pDG364-cotB-gst-sep, pDG364-cotB khi đƣợc cắt bằng HindIII và
EcoRI cho băng với kích thƣớc tƣơng ứng 8,0 kb, 7,4 kb ở đƣờng chạy 1, 3, đoạn gen vp28 sau khi cắt từ pGEM-vp28 cho một băng DNA có kích thƣớc khoảng 615 bp đƣờng chạy 6. Các kết quả này đúng nhƣ tính toán lý thuyết.
86
Hình 3.8: Điện di sản phẩm cắt giới hạn pDG364-cotB-gst-sep, pDG364-cotB, pGEM-vp28 với hai cặp enzyme EcoRI và HindIII
1 : pDG364-cotB-gst-sep đã cắt M : Thang chuẩn DNA 1 kb 2: pDG364-cotB-gst-sep chƣa cắt 5: pGEM-vp28 chƣa cắt 3: pDG364-cotB đã cắt 6: pGEM-vp28 đã cắt 4: pDG364-cotB chƣa cắt
Cả hai vector và đoạn vp28 lúc này đều đã chứa các trình tự nhận biết enzyme giới hạn HindIII và EcoRI và đã đƣợc tinh sạch.. Phản ứng nối vp28 vào vector pDG364-cotB, pDG364-cotB-gst đƣợc tiến hành với các thành phần và thời gian đƣợc nêu ở phần 2.3.4.3. Các khuẩn lạc thu đƣợc sau quá trình biến nạp đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR, với cặp mồi của vp28 và của vector pDG364. Kết quả PCR với khuôn là khuẩn lạc trắng thu đƣợc từ đĩa thạch biến nạp sản phẩm gắn gen mã hóa VP28 vào vector pDG364-cotB đƣơ ̣c trình bày ở hình 3.9A. Trên lý thuyết, nếu nhƣ đoạn vp28 đƣợc gắn tiếp vào vector tái tổ hợp, đối với vector tái tổ hợp pDG364-cotB-vp28 sản phẩm PCR thu đƣợc khi chạy với cặp mồi vp28.3 Fw và vp28.3 Rv cho băng 615 bp của vp28, còn với cặp mồi 364 Fw và 364 Rv thì kích thƣớc băng thu đƣợc là khoảng 1,7 kb, bằng tổng kích thƣớc của hai đoạn cotB và vp28 cùng với khoảng cách giữa hai vị trí gắn mồi 364 Fw và 364 Rv. Chế độ nhiệt của phản ứng PCR sử dụng mồi vector nhƣ sau:
87 94oC : 30 giây
56oC : 45 giây x 30 chu kỳ 72oC : 1 phút 30 giây
Sau khi tiến hành phản ứng PCR cho 3 khuẩn lạc đƣợc chọn ngẫu nhiên, sử dụng các cặp mồi trên, kết quả điện di sản phẩm PCR đƣợc thể hiện ở hình 3.9A.
Hình 3.9A: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra các khuẩn la ̣c từ đĩa thạch biến nạp sản phẩm gắn của gen mã hóa VP28 và pDG364-cotB bằng cặp mồi vp28,
cotB và pDG364
M:Thang chuẩn DNA 1 kb
1: Đối chứng âm (không có DNA khuôn)
2-4 : PCR khuẩn lạc (1-3) bằng cặp mồi vector pDG364 5-7: PCR khuẩn lạc (1-3) bằng cặp mồi vector cotB 8-10:PCR khuẩn lạc (1-3) bằng cặp mồi của vector vp28
Trong số 3 khuẩn lạc đƣợc lựa chọn để kiểm tra đã cho kết quả dƣơng tính với kích thƣớc băng DNA xuất hiện trên bản gel điện di agarose là 615 bp khi PCR với mồi vp28 (đƣờng chạy 8-10), khoảng 1,1 kb khi PCR với mồi cotB (đƣờng chạy 5-7) và khoảng 1,7 kb khi kiểm tra với mồi pDG364 (đƣờng chạy 2-4). Kích thƣớc này phù hợp với các tính toán nêu trên, chứng tỏ cả 3 khuẩn la ̣c này đều chƣ́a vector pDG364 mang đoạn gen dung hợp cotB-vp28.
Tƣơng tự nhƣ vậy, sản phẩm PCR với khuôn là DNA của 04 khuẩn lạc trắng từ đĩa thạch biến nạp sản phẩm gắn của gen mã hóa vp28 và pDG364-cotB-
88
gst (hình 3.9B) cho thấy các khuẩn lạc cho băng DNA kích thƣớc 2,5 kb (Hình 3.9B, đƣờng chạy 1-4) bằng tổng kích thƣớc của hai đoạn cotB (1,1 kb), gst (0.5 kb) và vp28 (615 bp) cùng với khoảng cách giữa hai vị trí gắn mồi 364 Fw và 364 Rv (0.3 kb). Đồng thời, sản phẩm PCR thu đƣợc khi chạy bằng cặp mồi vp28.3 Fw và vp28.3 Rv cho băng có kích thƣớc khoảng 615 bp của vp28. Kết quả cho thấy cả 4 khuẩn lạc này đều chƣ́a vector pDG364-CotB-GST mang đoa ̣n gen vp28.
Hình 3.9B: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra các khuẩn la ̣c từ đĩa thạch biến nạp sản phẩm gắn của gen mã hóa VP28 và pDG364-cotB-GST bằng cặp mồi
pDG364 và vp28.
1-4: PCR khuẩn lạc (1-4) bằng cặp mồi vector pDG364 5,6: Đối chứng âm (không có DNA khuôn)
M: Thang chuẩn DNA 1 kb
7-10: PCR khuẩn lạc (1-4) bằng cặp mồi của vector vp28
Những kết quả này cho phép sơ bộ khẳng định đoạn gen vp28 đã đƣơ ̣c gắn thành công vào vector pDG 364-cotB, pDG364-cotB-gst tạo thành vector tái tổ hợp pDG364-cotB-vp28, pDG364-cotB-gst-vp28. Khuẩn lạc số 2 đƣợc chọn nuôi và tách plasmid cho các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả PCR kiểm tra plasmid với các cặp mồi đặc hiệu trên cũng thu đƣợc kết quả hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết. Kết quả đọc trình tự cho thấy đã đƣa đƣợc gen mã hóa VP28 vào vector pDG364-cotB và pDG364-cotB-gst đúng trình tự và vị trí khung đọc. Nhƣ vậy, có
89
thể kết luâ ̣n rằng chúng tôi đã t ạo thành công vector tái tổ hợp pDG364-cotB-vp28 và pDG364-cotB-gst-vp28.
Để dung hợp đoạn gen cotB-vp28 vào hệ gen của B. subtilis PY79 dựa trên cơ chế trao đổi chéo tƣơng đồng kép, chúng tôi đã sử dụng enzyme XhoI để mở vòng vector này và sau đó tiến hành biến nạp vào tế bào B. subtilis PY79. Kết quả biến nạp đã thu đƣợc một số khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy. 30 khuẩn lạc đƣợc lƣ̣a chọn ngẫu nhiên để nuôi môi trƣờng LB đặc có bổ sung 1% tinh bột chứa chloramphenicol 5 µg/ml và nuôi ở 42oC qua đêm. Khi nhuộm màu iot đĩa nuôi cấy, các khuẩn lạc B. subtilis PY79 ban đầu vì tổng hợp đƣợc amylase nên xuất hiện vòng phân giải tinh bột. Ngƣợc lại, các khuẩn lạc B. subtilis mang đoạn gen dung hợp thành công sẽ không xuất hiện vòng phân giải tinh bột nào là hệ quả của việc mất khả năng tổng hợp amylase (Hình 3.10).
A B
Hình 3.10: Kiểm tra sự có mặt của gen dung hợp trong DNA hệ gen B. subtilis
A) Đĩa thạch LB chứa các khuẩn lạc B. subtilis mọc đƣợc trên môi trƣờng có kháng sinh CM
B) Đĩa (A) sau khi lựa chọn cấy chuyển sang đĩa LB+ tinh bột 1%, gạt bỏ các khuẩn la ̣c để kiểm tra vòng phân giải tinh bô ̣t
1-30: các khuẩn lạc kiểm tra 1-30
ĐC(-): B. subtilis PY 79 dạng thể dại không chứa đoạn gen dung hợp
Kết quả thu đƣợc ở hình 3.10 cho thấy tại vi ̣ trí các khuẩn la ̣c chƣ́a đoa ̣n gen dung hơ ̣p (các khuẩn lạc 1-30) không xuất hiê ̣n vòng phân gi ải tinh bột, trong khi đó đối chƣ́ng âm là da ̣ng B. subtilis PY79 ban đầu có vòng p hân giải tinh bột rất rõ
90
ràng. Nhƣ vậy các khuẩn lạc đƣợc kiểm tra đều không còn khả năng t ổng hợp amylase phân hủy tinh bô ̣t , đoạn gen cotB-vp28 đã đƣợc dung hợp vào hệ gen B. Subtilis PY79. Một số khuẩn lạc đƣợc chọn nuôi, tạo bào tử để kiểm tra sự biểu hiện của VP28.
Để kiểm tra chắc chắn sự có mặt của gen cotB-vp28 trong hệ gen của B. subtilis, chúng tôi tiến hành tách DNA tƣ̀ 02 khuẩn lạc dƣơng tính thu đƣợc từ phƣơng pháp kiểm tra hoạt tính sinh amylase. Sử dụng DNA tách đƣợc này làm khuôn cho PCR với các cặp mồi vp28, cotB, pDG364, kết quả thu đƣơ ̣c (Hình 3.11) cho thấy kích thƣớc băng DNA xuất hiện trên bản gel điện di agarose hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết.
A B
Hình 3.11: Kiểm tra sự có mặt của gen cotB-vp28 trong hệ gen của B. subtilis
A: Điện di kiểm tra tách genome B: Điện di sản phẩm PCR genome với các cặp mồi đặc hiệu
M:Thang chuẩn DNA 1 kb 3-4 : PCR bằng cặp mồi vector pDG364 1, 2: DNA genome của 02 khuẩn lạc
B. subtilis CotB-VP28
5-6: PCR bằng cặp mồi cotB 7-8:PCR bằng cặp mồi của vp28
Từ kết quả này, có thể kết luận rằng đã dung hợp thành công gen cotB-vp28
91
hành tƣơng tự chúng tôi cũng đã dung hợp thành công gen cotB-gst-vp28 vào hệ gen của B. subtilis và đặt tên chủng tái tổ hợp là B. subtilis CotB-GST-VP28.
3.2.2.2. Biểu hiện và kiểm tra biểu hiện protein dung hợp CotB-VP28, CotB-GST- VP28 trên bề mặt bào tử B. subtilis
Viê ̣c tạo bào tử đã đƣợc thƣ̣c hiê ̣n bằng cách nuôi lắc ở 37oC trong 2 ngày, sau đó tiến hành thu bào tử và xử lý theo quy trình. Khả năng tạo bào tử của B. subtilis tái tổ hợp đƣợc kiểm tra bằng soi kính hiển vi.
Hình 3.12: Bào tử quan sát dƣới kính hiển vi
A: Bào tử đƣợc hình thành từ B. subtilis chủng PY79
B: Bào tử đƣợc hình thành từ B. subtilis tái tổ hợp mang đoạn gen cotB-vp28 C: Bào tử đƣợc hình thành từ B. subtilis tái tổ hợp mang đoạn gen cotB-gst-vp28
So sánh bào tử của chủng chuẩn B. subtilis PY79 với bào tử của chủng cotB- vp28 và cotB-gst-vp28 (Hình 3.12), chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt về mặt hình thái. Bào tử tạo thành bởi 3 chủng đều đạt hơn 95%. Với hiệu suất tạo bào tử cao, chúng tôi tiếp tục tiến hành các thí nghiệm đánh giá sự biểu hiện của protein dung hợp trên bề mặt bào tử.
Để xác định VP28 có biểu hiện trên lớp áo của bào tử và dung hợp với cotB hoặc cotB-GST hay không, chúng tôi đã sử dụng dịch chiết tổng số thu đƣợc từ 5× 109 bào tử chủng B. subtilis PY79, CotB-VP28, và CotB-GST-VP28 cho phân tích bằng thẩm tách miễn di ̣ch sƣ̉ du ̣ng kháng thể đơn dòng kháng VP28. Sau khi xử lý bào tử bằng dung dịch tách chiết chứa SDS 10% và DTT 1M, li tâm thu dịch nổi, chúng tôi đã thu đƣợc dịch chiết chứa các protein của lớp áo bào tử. Vì sản phẩm cuối cùng mà chúng tôi hy vọng biểu hiện đƣợc là một protein dung hợp giữa CotB
92
và VP28 nên kích thƣớc băng protein hiện trên màng sẽ là tổng của hai thành phần CotB (kích thƣớc khoảng gần 35 kDa) và VP28 (kích thƣớc 28 kDa). Nhƣ vậy, theo tính toán lý thuyết, protein dung hợp cotB-vp28 sẽ có kích thƣớc khoảng 63 kDa, trong khi đó protein dung hợp CotB-GST-VP28 sẽ có kích thƣớc khoảng 89 kDa bằng tổng của ba thành phần CotB (35 kDa), GST (26 kDa) và VP28 (kích thƣớc 28 kDa).
Hình 3.13: SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra sự biểu hiện VP28 trên bào tử B. subtilis
(+): Đối chứng dƣơng, protein VP28 tinh sạch (~ 28 kDa) M: Thang chuẩn protein
1: Bào tử B. subtilis CotB-VP28 biểu hiện cotB-vp28 (~ 63 kDa) 2: Bào tử B. subtilis PY79 chủng chuẩn không có protein dung hợp 3: Bào tử B. subtilis CotB-GST-VP28 biểu hiện cotB-gst-vp28 (~ 89 kDa)
Kết quả SDS-PAGE và thẩm tách miễn dịch (Hình 3.13) cho thấy sự xuất hiện băng protein với khối lƣợng phân tử (KLPT) khoảng 63 kDa trong dịch chiết bào tử cotB-vp28 (đƣờng chạy 1) và băng protein với khối lƣợng phân tử khoảng 89 kDa trong dịch chiết áo bào tử tƣơng ứng với kích thƣớc của CotB-GST-VP28 theo tính toán lý thuyết (đƣờng chạy 3). Trong khi đó, ở đƣờng chạy số 2 là mẫu bào tử hình thành từ tế bào B. subtilis chủng PY79 không xuất hiện băng protein nào.
93
Áp dụng phƣơng pháp đƣợc mô tả bởi Nguyen và tập thể [73] dùng phần mềm SCION IMAGE, chúng tôi đã ƣớc tính đƣợc lƣợng VP28 chiết xuất từ 5x109 bào tử CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 vào khoảng 225 ng. Căn cứ vào khối lƣợng phân tử của VP28 (27,5 kDa), có thể tính toán rằng khoảng 1000 phân tử CotB- VP28, CotB-GST-VP28 đƣợc thể hiện trên một bào tử tái tổ hợp. Kết quả này, bƣớc đầu khẳng định bào tử B. subtilis của 2 chủng tái tổ hợp đã biểu hiện protein dung hợp CotB-VP28, CotB-GST-VP28.
Để có thêm minh chƣ́ng về sƣ̣ biểu hiện của VP28 và GST-VP28 trên bề mă ̣t bào tử, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra khả năng biểu hiện của chúng trên bề mặt bào tử bằng phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang. VP28, GST-VP28 dung hợp với cotB biểu hiện trên bề mặt bào tử đƣợc nhận biết bởi kháng thể sơ cấp kháng VP28, phức hệ này sau đó đƣợc liên kết đặc hiệu với kháng thể thứ cấp có gắn với chất phát huỳnh quang Alexa 546. Khi soi dƣới kính hiển vi huỳnh quang với bƣớc sóng thích hợp sẽ quan sát đƣợc các tín hiệu huỳnh quang. Về lí thuyết, nếu có màu đỏ trên bào tử thì chứng tỏ bào tử đã biểu hiện VP28.
Nhƣ có thể thấy t rên hình 3.14, ở mẫu đối chứng âm là mẫu bào tử PY79 thể dại, các tín hiệu màu đỏ quan sát đƣợc rất yếu, hầu nhƣ không rõ. Trong khi đó, ở cùng điều kiện kích thích, mẫu bào tử CotB-VP28, CotB-GST-VP28 cho thấy các tín hiệu màu đỏ sáng nét, rõ ràng, chứng tỏ bào tử tái tổ hợp có sƣ̣ bi ểu hiện VP28 mạnh trên bề mặt . Các ảnh chụp ánh sáng trắng tƣơng ƣ́ng cho phép kh ẳng định, các vị trí phát ra tín hiệu màu đỏ là các vị trí có bào tử và đƣợc phát ra từ bề mặt bào tử. Các kết quả thu đƣơ ̣c cho phép k ết luận rằng chúng tôi đã bi ểu hiện thành công protein dung hợp CotB-VP28, CotB-GST-VP28 trên bề mặt bào tử B. subtilis.
94
Hình 3.14: Ảnh chụp phân tích miễn dịch huỳnh quang kiểm tra biểu hiện CotB- VP28 và CotB-GST-VP28 trên bề mặt bào tử B. subtilis
A Hình ảnh bào tử PY79 dƣới kính hiển vi huỳnh quang trong điều kiện ánh sáng huỳnh quang alexa (534 nm), ánh sáng trắng và ánh sáng kết hợp
B Hình ảnh bào tử CotB-VP28 dƣới kính hiển vi huỳnh quang trong điều kiện ánh sáng huỳnh quang alexa (534 nm), ánh sáng trắng và ánh sáng kết hợp
C Hình ảnh bào tử CotB-GST-VP28 dƣới kính hiển vi huỳnh quang trong điều kiện ánh sáng huỳnh quang alexa (534 nm), ánh sáng trắng và ánh sáng kết hợp
Những kết quả thu đƣợc ở trên phù hợp với những nghiên cứu trƣớc đây của Isticato và tập thể ƣớc tính xuất hiện khoảng 1.5×103 phân tử TTFC của virus uốn ván trên bề mặt của mỗi bào tử [42]. Trong nghiên cứu tƣơng tự, Ning và tập thể