subtilis biểu hiện VP28
Một số enzyme trong máu (hemolymph) nhƣ phenoloxidase (PO), superoxide dismutase (SOD), hay enzyme nitric oxide synthase cảm ứng (iNOS) trong tế bào máu (hemocyte) đƣơ ̣c xem là có liên quan đến đáp ứng miễn dịch ở tôm [34, 86]. Trong nghiên cứu này để đánh giá khả năng kích thích miễn dịch của
B. subtilis biểu hiện VP28 chúng tôi lựa chọn hai thông số là hoạt độ SOD và PO. 3.3.2.1. Hoạt độ phenoloxidase (PO)
Vì tôm thẻ chân trắng có kích thƣớc rất nhỏ nên việc thu mô ̣t lƣợng máuđủ lớn cho phân tích là gần nhƣ không thể . Hơn nƣ̃a, hoạt đô ̣ PO đƣợc cho là có tính đặc hiệu khác nhau khi đƣợc phân tích ở các vị trí khác nhau [66] nên chúng tôi đã tiến hành phân tích hoạt độ PO của mẫu dịch nghiền đồng thể cơ tim.
Kết quả phân tích hoạt độ PO của các mẫu tôm cho ăn bào tử B. subtilis khác nhau (hình 3.20) cho thấy hoạt đô ̣ PO của tôm ăn thức ăn có bổ sung bào tử thể dại PY79, bào tử B. subtillis CotB-VP28 hay CotB-GST-VP28 đều cao nhất ở ngày 7. Đặc biệt tôm ăn thức ăn chƣ́a bào tƣ̉ cotB -VP28 có hoạt độ PO cao hơn mẫu đối chƣ́ng không ăn bào tƣ̉ 120% và cao hơn mẫu ăn bào tƣ̉ thể da ̣i PY 79 khoảng 10%. Mƣ́c tăng hoa ̣t đô ̣ PO của mẫu tôm ăn bào tƣ̉ cotB -GST-VP28 so vớ i mẫu đối chƣ́ng hay mẫu ăn thƣ́c ăn chƣ́a bào tƣ̉ PY 79 chỉ thể hiện ở ngày 14 cũng ở mức 10 %.
103
Hình 3.20: Hoạt độ phenoloxidase (PO) trong dịch chiết cơ tim của tôm thẻ chân trắng ăn bào tử tái tổ hợp
Hoạt độ PO trong di ̣ch chiết cơ tim c ủa tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn công nghiệp
Hoạt độ PO trong di ̣ch chiết cơ tim c ủa tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn công nghiệp trộn bào tử PY79 với mật độ 109 CFU/g
Hoạt độ PO trong di ̣ch chiết cơ tim c ủa tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn công nghiệp trộn bào tử CotB-VP28 với mật độ 109 CFU/g
Hoạt độ PO trong di ̣ch chiết cơ tim c ủa tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn công nghiệp trộn bào tử CotB-GST-VP28 với mật độ 109 CFU/g
Kết quả làm tăng hoạt độ PO ở tôm thể chân trắng của chế phẩm bào từ cotB-VP28 và cotB-GST-VP28 này cũng tƣơng tƣ̣ nhƣ các kết quả thu đƣợc của Fu và tập thể về tác dụng trên đối tƣơ ̣ng tôm Fenneropenaeus chinensis [34].
104 3.3.2.2. Hoạt độ superoxide dismutase (SOD)
Hình 3.21: Hoạt độ enzyme SOD trong mô thịt của tôm thẻ chân trắng
Hoạt độ enzyme SOD trong mô thịt của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn công nghiệp
Hoạt độ enzyme SOD trong mô thịt của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn công nghiệp trộn bào tử PY79 với mật độ 109 CFU/g
Hoạt độ enzyme SOD trong mô thịt của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn công nghiệp trộn bào tử CotB-VP28 với mật độ 109 CFU/g
Hoạt độ enzyme SOD trong mô thịt của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn công nghiệp trộn bào tử CotB-GST-VP28 với mật độ 109 CFU/g
Viê ̣c phân tích hoạt độ SOD đƣợc thực hiện với dịch chiết mô thịt của tôm thẻ chân trắng tại các thời điểm 0 ngày, 7 ngày và 14 ngày sau khi cho ăn thức ăn không và có trộn bào tử B. subtilis dạng dại PY 79, bào tử CotB-VP28 và CotB- GST-VP28. Kết quả phân tích hoa ̣t đô ̣ SOD của các mẫu tôm khác nhau (hình 3.21) cho thấy, hoạt độ SOD tăng lên theo thời gian ở tất cả các mẫu nghiên cƣ́u . Ở thời điểm 7 ngày sau khi ăn thức ăn có trộn bào tử PY79, CotB-VP128 hay CotB-GST- VP28, hoạt độ SOD có tăng cao hơn mẫ u đối chƣ́ ng (ăn thƣ́c ăn không chƣ́a bào tƣ̉). Tuy vâ ̣y, không có sƣ̣ khác biê ̣t về hoa ̣t đô ̣ SOD giƣ̃a 3 mẫu tôm ăn các da ̣ng bào tử khác nhau . Ở thời điểm 14 ngày, hoạt độ SOD của tôm ăn thức ăn có trộn
105
bào tử PY79, cotB-VP28 và cotB-GST-VP28 tăng hơn so với mẫu đối chƣ́ng, tƣơng ứng là 51,5%, 30% và 85%. Đặc biệt, mẫu tôm ăn bào tƣ̉ cotB -GST-VP28 có hoạt đô ̣ SOD cao nhất . Sƣ̣ khác biê ̣t về mƣ́c đô ̣ làm tăng hoa ̣t đô ̣ S OD ở tôm khi ăn bào tƣ̉ PY79, cotB-VP28 và cotB-GST-VP28 là vấn đề thú vị cần đƣợc tiếp tục nghiên cƣ́u.
Trong mô ̣t nghiên cƣ́u tƣơng tƣ̣ gần đây Fu và tâ ̣p thể [34] cũng phát hiện thấy sƣ̣ tăng hoa ̣t đô ̣ SOD ở tôm Fenneropenaeus chinensis khi đƣơ ̣c ăn bào tƣ̀ B. subtilis có biểu hiện VP28 trên bề mặt.
Các kết quả đánh giá hoạt độ PO và SOD ở tôm thẻ chân trắng khi cho ăn bào tử B. subtilis có và không có VP28 trên bền mặt bào tƣ̉ cho thấy có sƣ̣ tăng hoa ̣t đô ̣ của các hai enzyme này ở tôm thẻ chân trắng , trong đó ảnh hƣởng của chế phẩm bào tử có biểu hiện VP 28 trên bề mă ̣t bào tƣ̉ là rõ nét hơn cả . Đây là những cơ sở ban đầu về đáp ƣ́ng miễn di ̣ch ở tôm khi đƣợc kích thích bởi các chế phẩm bào tƣ̉ B. subtilis.
3.3.3. Đánh giá khả năng bảo hộ trên tôm thẻ chân trắng của bào tử tái tổ hợp
3.3.3.1. Tách chiết WSSV
WSSV đƣợc thu nhận từ nguồn tôm bệnh tại trang trại nuôi tôm ở Điền Hƣơng, Phong Điền, Huế. Mẫu tôm bê ̣nh đƣợc kiểm tra bằng PCR để khẳng đi ̣nh nhiễm WSSV trƣớ c khi tiến hành chiết virus . Tƣ̀ 8 kg mẫu tôm nhiễm bệnh đốm trắng chúng tôi đã thu đƣợc 500 ml dung dịch có chứa virus gây bệnh đốm trắng, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Trƣớc khi tiến hành xác định liều LD75 chúng tôi đã tiến hành định lƣợng nồng độ WSSV trong dịch thu đƣợc bằng real-time PCR. Kết quả thu đƣợc đƣợc trình bày ở các hình 3.22, 3.23 và bảng 3.6.
106
Hình 3.22: Đồ thị tín hiệu quang phản ánh số copy sản phẩm PCR nhân bản từ các mẫu DNA tinh sạch từ các mẫu tôm nghi nhiễm đốm trắng sau các chu kỳ
Hình 3.23: Đƣờng chuẩn thể hiện mối tƣơng quan giữa nồng độ WSSV (copy/ml) và chu kỳ ngƣỡng, với E = 97.2%, R2 = 0.991
Kết quả phân tích nồng đô ̣ virus bằng real-time PCR là có độ tin cậy cao, thể hiê ̣n ở đƣờng chuẩn có độ hồi quy tuyến tính tốt, giá trị R2
= 0,991. Từ kết quả thu đƣợc, chúng tôi tính đƣợc nồng độ virus trong 04 mẫu WSSV No1-No4 tƣơng ƣ́ng
107
là 2,15 x 107 copy/ml, 1,71 x 106 copy/ml; 2,08 x 107 copy/ml; 7,73 x 108 copy/ml (Bảng3.6).
Bảng 3.6: Số copy trong từng dung dịch WSSV
Tên mẫu Số copy /ml
WSSV No1- nhân lên từ tôm sú (ĐH Cần Thơ) 2,15 x 107
WSSV No2 (Viện RIA2-TPHCM) 1,71 x 106
WSSV No3 – nhân lên từ tôm thẻ chân trắng (Viện RIA1) 2,08 x 107
WSSV No4 (PTNTĐCNEP) 7,73 x 108
3.3.3.2. Xác định liều gây chết tôm 75% (LD75) của dịch WSSV
Kết quả thu đƣợc từ thí nghiệm cảm nhiễm tôm thẻ chân trắ ng bằng WSSV (Hình 3.24) cho thấy bắt đầu xuất hiện tôm chết ở lô nồng độ WSSV 2,6x105 copy/ml, từ 2 - 4 ngày sau khi cảm nhiễm bằng virus. Đến ngày thứ 5, trên 75% tôm ở lô có nồng độ WSSV 2,6x105, 2,6x104 copy/ml đã bị chết và đến ngày thứ 6 và thứ 7 thì 100% tôm ở các lô có nồng độ WSSV tƣơng ƣ́ng 2,6x105 và 2,6x104 copy/ml đã bị chết . Còn ở lô có nồng độ WSSV2,6x102
copy/ml và 2,6x103 copy/ml tỷ lệ tôm chết ở ngày thứ 7 đạt mƣ́c 46,7% và 56,7%. Trong khi đó tỷ lệ tôm chết tự nhiên ở lô đối chứng âm (không bi ̣ cảm nhiễm WWSSV ) là 6,3%. Các dấu hiệu bệnh lý của tôm thí nghiệm quan sát đƣơ ̣c cũng tƣơng tự nhƣ tôm nhiễm WSSV ngoài tự nhiên. Tôm thử nghiệm thƣờng có dấu hiệu bỏ ăn (thức ăn dƣ thừa nhiều), lƣời vận động, đỏ thân và một số xuất hiện đốm trắng ở dƣới mang. Ngoài ra một số tôm chết nhƣng không có dấu hiệu bệnh lý, tuy nhiên chúng tôi vẫn thu đƣợc kết quả dƣơng tính khi tiến hành kiểm tra sự hiện diện của WSSV bằng phƣơng pháp PCR.
108
Hình 3.24: Tỷ lệ chết tích lũy của các lô tôm khi cảm nhiễm với WSSV ở nồng khác nhau là 2,6x105, 2,6x104, 2,6x103 và 2,6x102 copy/ml
Từ kết quả thu đƣợc chúng tôi xác định đƣợc liều LD75 nằm trong khoảng 2,6 x 104 đến 2,6 x 103
copy/ml. Để xác định chính xác hơn liều LD75 chúng tôi tiến hành thí nghiệm tƣơng tự với 4 nồng độ WSSV khác nhau (trong dãy 2,6 x 104 đến 2,6 x 103 copy/ml) là 2,6 x 104, 1,3 x 104, 0,65 x 104 và 0,3 x 104 copy/ml. Kết quả theo dõi tỷ lệ chết tích lũy của các lô đƣợc thể hiện ở hình 3.25 và cho thấy ở ngày thứ 6, 86,7% tôm ở có nồng đô ̣ WSSV2,6 x 104 copy/ml bị chết, và đến ngày thứ 7, thì 100% tôm ở lô này đều bi ̣ chết , còn ở nồng độ WSSV 1,3 x 104 copy/ml, đến ngày thứ 7 có tới 76,7% bị chết. Từ kết quả thu đƣợc chúng tôi xác định đƣợc liều LD75 là 1,3 x 104 copy/ml và liều này đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu cƣờng độc về sau.
109
Hình 3.25: Tỷ lệ chết tích lũy của các lô tôm khi cảm nhiễm với WSSV ở nồng độ khác nhau là 2,6 x 104
, 1,3 x 104, 0,65 x 104 và 0,3 x 104 copy/ml
3.3.3.3. Đánh giá khả năng bảo hộ của bào tử tái tổ hợp
Những nghiên cứu trƣớc đây đã chỉ ra rằng bảo vệ và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu có thể đƣợc cảm ứng ở động vật không xƣơng sống và đặc hiệu hơn cả là ở giáp xác [110], các đánh giá về sau đã chỉ ra rằng kháng nguyên chính của WSSV, VP28 có thể kích thích phản ứng miễn dịch kháng WSSV bằng con đƣờng uống hoặc tiêm [45, 114]. Nhằm xác định khả năng phòng bệnh đốm trắng ở tôm thẻ chân trắng bởi chế phẩm bào tử B. subtilis cotB-VP28 và cotB -GST-VP28, chúng tôi đã bố trí các lô tôm thí nghiệm khác nhau, trong đó bao gồm các mẫu đối chƣ́ng âm (tôm không nhiễm WSSV ), đối chƣ́ng dƣơng (tôm cho nhiễm WSSV nhƣng ăn thƣ́c ăn không chƣ́a bào tƣ̉ ) và lô thí nghiệm (tôm cho nhiễm WSSV nhƣng ăn thƣ́c ăn chƣ́a bào tƣ̉ PY79, hay cotB-VP28 hay cotB-GST-VP28).
110
Các nghiệm thức đƣợc cho ăn thức ăn tƣơng ứng sau 14 ngày, đƣợc công cƣờng độc với WSSV ở nồng độ 1,3x104
copy/ml. Tôm tiếp tục cho ăn thức ăn thử nghiệm tƣơng ứng và theo dõi số lƣợng tôm trong 14 ngày ngày tiếp theo.
Hình 3.26: Tỷ lệ chết tích lũy của các lô tôm khi đánh giá khả năng bảo hộ của bào tử tái tổ hợp
Tỷ lệ chết tích lũy của các của các lô tôm thẻ chân trắng đối chứng âm Tỷ lệ chết tích lũy của các của các lô tôm thẻ chân trắng đối chứng dƣơng Tỷ lệ chết tích lũy của các của các lô tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn công nghiệp trộn bào tử PY79 với mật độ 109 CFU/g
Tỷ lệ chết tích lũy của các của các lô tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn công nghiệp trộn bào tử CotB-VP28 với mật độ 109 CFU/g
Tỷ lệ chết tích lũy của các của các lô tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn công nghiệp trộn bào tử CotB-GST-VP28 với mật độ 109 CFU/g
Kết quả thí nghiệm (Hình 3.26) cho thấy tôm ở các lô đối chƣ́ng dƣơng (sau khi công cƣờng độc với nồng độ WSSV là 1,3x104 copy/ml) có biểu hiện ăn ít và bắt đầu chết sau 2 ngày. Tỷ lệ chết tích lũy tăng nhanh từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 9
111
và tỷ lệ tôm chết tích lũy là 100% ở ngày 11 sau khi cƣờng độc. Tại các nghiệm thức thử nghiệm khi cho tôm ăn có bổ sung bào tử PY79, tôm thử nghiệm xuất hiện hiện tƣợng ăn ít ở ngày thứ 5. Tỷ lệ tôm chết tích lũy tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 11 sau cƣờng độc với WSSV. Tỷ lệ tôm chết tích lũy đạt 94,5% sau 14 ngày cƣờng độc với WSSV ở nồng độ là 1,3 x 104
copy/ml. Tôm chết có các dấu hiệu đặc trƣng của bệnh đốm trắng (bỏ ăn - thức ăn dƣ thừa nhiều, lƣời vận động, đỏ thân và một số xuất hiện đốm trắng ở dƣới mang) đồng thời có kết quả dƣơng tính khi tiến hành kiểm tra sự hiện diện của WSSV bằng phƣơng pháp PCR. Tại các nghiệm thức thử nghiệm cho ăn thức ăn trộn bào tử tái tổ hợp CotB-VP28, CotB- GST-VP28 và lô đối chứng âm tỷ lệ chết tích lũy sau 14 ngày theo ghi nhận đƣợc tƣơng ứng là 19,23%, 26,67% và 25,81%.
Mƣ́ c đô ̣ bảo bộ của các dạng bảo tử CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 ở mật độ bào tử 1 x 109
CFU/g thức ăn đối với tôm thẻ chân trắng khi công cƣờng độc với WSSV tƣơng ứng là 81% và 73,3%. Kết quả này chƣ́ng tỏ rằng bào tử B. subtilis
CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 đều có tiềm năng bảo vệ tôm chống lại WSSV. Ngoài ra, chúng tôi quan sát đƣợc lô tôm cho ăn bào tử PY79 chết chậm hơn lô tôm ăn thức ăn không bổ sung bào tử, mặc dù tỷ lệ chết ở ngày 14 cũng lên tới 94,5%. Từ đó có thể nhận thấy rằng, bản thân bào tử vi khuẩn PY79 cũng có khả năng tăng cƣờng miễn dịch của tôm, giúp cho tôm làm chậm sự tấn công của virus đốm trắng. Số liệu tƣơng tự cũng cho thấy khả năng bảo vệ tôm chống WSSV thấp ở nhóm cho ăn tế bào sinh dƣỡng B. subtilis dại (20%) [34] và bào tử của chủng này (13%) [74].
Cho đến nay , phần lớn các kết quả nghiên cứu tạo các vaccine thế hệ mới có thể sử dụng qua đƣờng thức ăn đều đƣợc thiết kế dựa trên cấu trúc kháng nguyên VP28 của WSSV [16, 44, 70, 91, 114] và chứng tỏ có nhiều triển vọng . VP28 tái tổ hợp trộn với thức ăn tôm để thử nghiệm dạng vaccine đƣờng uống này cho tôm sú
P. monodon, P. (Marsupenaeus) japonicus thu đƣợc hiệu quả bảo vệ từ 30-70% tùy thuộc vào hàm lƣợng VP28 cho tôm ăn và thời điểm nhiễm virus sau khi cho tôm ăn protein VP28 tinh sạch [16, 114]. Tuy nhiên, hiệu quả bảo vệ thu đƣợc giảm theo thời gian, nếu nhƣ không liên tục cho tôm ăn thức ăn chứa protein VP28. Kết quả
112
nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, khả năng bảo hộ của các dạng bảo tử B. subtilis
CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 đối với tôm thẻ chân trắng ở mức lớn hơn 70% là tƣơng đối phù hợp với các công bố gần đây của nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng B. subtilis có biểu hiện VP28 nhƣ một dạng vaccine qua đƣờng uống để phòng chống nhiễm WSSV trong tôm nuôi. Fu và tập thể [34] đã tạo ra một chủng vi khuẩn B. subtilis tái tổ hợp biểu hiện mạnh VP28 có khả năng bảo vệ miễn dịch tới 83% chống lại WSSV ở một loài tôm Trung quốc (F. chinensis) khi cảm nhiễm ở ngày thứ 14. Tuy vậy, khả năng bảo vệ miễn dịch chống lại WSSV vẫn bị giảm dần khi nhiễm virus từ tuần thứ 2 sau khi ngừng cho tôm ăn vi khuẩn tái tổ hợp chứa VP28. Ning và tập thể [74] đã phát triển B. subtilis tái tổ hợp biểu hiện VP28 và thu đƣợc mức độ bảo vệ khoảng 46-50% ở tôm Cambarus clarkii chống lại WSSV. Mặc dù vậy, Ning và tập thể [74] không đánh giá khả năng bảo vệ miễn dịch chống lại WSSV với L. vannamei cũng nhƣ không đánh giá các chỉ thị phản ánh tình trạng miễn dịch của tôm.
Mặt khác, kết quả nghiên cƣ́ u của chúng tôi cho th ấy hoạt độ PO và SOD tăng lên đáng kể trong cả ba nhóm tôm ăn thƣ́c ăn có chƣ́ a B. subtilis PY79, cotB- VP28, hay cotB -GST-Vp28, và mức độ tăng rõ nét đối với tôm ăn bào tử CotB- VP28 và CotB-GST-VP28. Enzyme superoxide dismutase (SOD) vớ i hoa ̣t tính phân hủy gốc superoxide đƣợc sinh ra từ quá trình thực bào nhờ đó có thể đã tăng cƣờng khả năng tiêu diệt tác nhân gây bệnh. Ngoài ra PO là một enzyme chứa nguyên tử đồng (Cu), xúc tác tiếp theo 2 quá trình o-hydroxyl hoá monophenol và oxy hoá