Các khuẩn lạc tế bào B. subtilis (ở dạng chủng chuẩn PY79, hay ở dạng chủng tái tổ hợp CotB-VP28, CotB-GST-VP28)đƣợc lựa chọn nuôi trong 5 ml môi trƣờng LB ở 37o
C trong 5-6 giờ. Sau đó, 3 ml môi trƣờng nuôi cấy đƣợc pha loãng trong 50 ml môi trƣờng LB mới, 2 ml dịch pha loãng đƣợc cấy trải lên đĩa thạch DSM (Difco Sporulation medium) và ủ ở 37o
C trong 60 giờ để tạo bào tử đƣợc thƣ̣c hiê ̣n nhƣ Harwood và tập thể mô tả trong [36]. Sau khoảng thời gian này, vi khuẩn bị kích thích và hình thành trạng thái nghỉ của nó là bào tử. Một cách khác để tạo
57
bào tử với số lƣợng lớn là 5 ml dịch nuôi cấy đƣợc bổ sung vào 1,2 lít dung dịch môi trƣờng DSM và lắc liên tục trong 48 giờ trong nồi lên men. Sau đó, bào tử đƣợc thu lại, xử lí bằng lysozyme để loại bỏ lớp nhày bao ngoài bào tử rồi rửa sạch bằng KCl 1M và NaCl 1M. Phần trăm bào tử tạo thành đƣợc đánh giá bằng cách soi dƣới kính hiển vi điện tử. Độ sống của vi khuẩn đo đƣợc khi xử lý ở nhiệt độ cao phản ánh số lƣợng bào tử tạo thành. Độ sống vi khuẩn đƣơ ̣c đánh giá theo các bƣớc nhƣ sau:
- Mẫu đƣợc xử lý nhiệt ở 65oC trong 20 phút.
- Mẫu đƣợc pha loãng đạt đến độ pha loãng 10-1 - 10-6.
- 100 µl của ống pha loãng 10-5 và 10-6 đƣợc cấy trải trên 03 đĩa môi trƣờng thạch LB đã bổ sung chloramphenicol 5 µg/ml.
- Các đĩa thạch đƣợc ủ ở 37oC trong 24 giờ sau đó số khuẩn lạc trên từng đĩa, đƣợc đếm và lấy giá trị trung bình ở những đĩa có số khuẩn lạc mọc trong khoảng từ 20-300.
Độ sống (CFU/ml) = Trung bình số vi khuẩn mọc trên đĩa x độ pha loãng
Sau đó, các mẫu bào tử đƣợc chia nhỏ vào ống eppendorf sạch chuẩn bị cho bƣớc thí nghiệm sau.
2.3.3. Tách chiết, định lƣợng DNA
2.3.3.1. Tách chiết DNA
Hệ gen của virus đƣợc chiết bằng kit MagPure viral DNA/RNA nano kit sử dụng hạt nano từ bọc silica với các bƣớc sau:
250 µl dịch virus đƣ ợc bổ sung 25 µl proteinase, 500 μl đệm ly giải đƣợc bổ sung và trộn đều. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 65oC trong 15 phút, 200 l isopropanol và 150 l hạt MagSi nano đƣợc bổ sung, trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ống mẫu sau đó đƣợc đặt lên nam châm để tập trung hạt từ, phần dịch trong đƣợc loại bỏ hoàn toàn. Hạt MagSi nano thu đƣợc lại tiếp tục đƣợc rửa hai lần bằng đệm rửa. Sau khi đệm rửa 2 lần, mẫu đƣợc giữ ở 70oC trong 2 phút để bay hơi hoàn toàn ethanol. 50-100 μl đệm rửa chiết đƣợc bổ sung, hỗn hợp đƣợc ủ ở
58
nhiệt độ phòng trong 2 phút để rửa chiết DNA. Dịch chứa DNA đƣợc đƣợc bảo quản ở -20oC cho các ứng dụng tiếp theo.
DNA plasmid đƣợc tinh sạch theo kit Qiaprep-miniprep, với các bƣớc chính nhƣ sau: Một khuẩn lạc (E. coli) đƣợc cấy vào 2 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh phù hợp và đƣợc nuôi lắc qua đêm ở 37o
C khoảng 200 vòng/phút 14-16 giờ. Dịch nuôi cấy đƣợc ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút để thu tế bào. Sau đó, tế bào đƣợc hoà trở lại trong 250 l đệm P1 có chứa RNase A 10 mg/ml. Tiếp đó 250 l đệm P2 đƣợc bổ sung vào hỗn hợp trên và đặt ở nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid. Hỗn hợp đƣợc trung hoà bằng 350 l đệm N3 đã đƣợc làm lạnh, đặt trên đá 5 phút. Dịch nổi đƣợc thu lại bằng ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút và đƣợc chuyển lên cột gel Qiagen, tiếp tục ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua. Cột Qiagen đƣợc rửa 2 lần bằng 500 l đệm PB, ly tâm 13.000 vòng/phút/phút. DNA trên cột sau đó đƣợc thu lại bằng cách bổ sung 100 l đệm EB (Tris-HCl 10 mM pH 8,5) hoặc nƣớc cất khử ion khử trùng vào giữa cột, tiến hành ly tâm 13.000 vòng/phút thu dịch. DNA plasmid sau tinh sạch đƣợc định lƣợng bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260 nm (A260) sƣ̉ du ̣ng công thƣ́c tính A260 =1 tƣơng đƣơng với hàm lƣợng DNA là 50 μg/ml. DNA plasmid đƣợc cho là sạch khi giá trị A260/A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0.
DNA hệ gen của B. subtilis đƣợc tách chiết bằng Qiamp DNA mini kit, với các bƣớc chính nhƣ sau: 5 ml dung dịch nuôi tế bào B. subtilis đƣợc ly tâm ở 7.500 vòng/phút trong 10 phút để thu sinh khối tế bào trong phần kết tủa. Sau đó, tủa đƣợc bổ sung 180 μl dung dịch lysozyme 20 mg/ml trong đệm Tris-HCl 20 mM, pH 8,0; EDTA 2 mM; Triton (X-100) 1,2%. Hỗn hợp đƣợc ủ 30 phút ở 37oC, và sau đó đƣơ ̣c bổ sung 20 μl proteinase K và 200 μl đệm AL. Hỗn hợp đƣợc trộn đều và ủ tiếp ở 56oC trong 30 phút, sau đó để ở 95oC trong 15 phút. Ở bƣớc tiếp theo, hỗn hợp phản ứng đƣợc bổ sung 200 μl ethanol 100%. Hỗn hợp sau đó đƣợc chuyển lên cột QIAamp Spin rồi ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút. Cột đƣợc rửa lần lƣợt bằng đệm AW1, AW2. Cuối cùng, cột đƣợc chuyển sang một ống 1,5 ml mới. 200
59
μl đệm AE đƣợc thêm vào và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút. Dịch qua cột chứa DNA đƣợc thu lấy và bảo quản ở -20o
C. 2.3.3.2. Nhân bản đoa ̣n gen mã hóa VP28 bằng kỹ thuâ ̣t PCR
Mỗi phản ứng PCR (25µl) chứa các thành phần nêu trong bảng 2.2
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (μl)
H2O cất khử trùng, khử ion Đệm Taq DNA polymerase 10X
Taq DNA polymerase 5 u/μl dNTP 2 mM
Mồi xuôi (Fw)10 pmol Mồi ngƣợc (Rv)10 pmol DNA khuôn (50-100 ng) 16,5 2,5 0,5 2,5 1,0 1,0 1,0 Tổng thể tích 25
Hỗn hợp PCR đƣợc trộn đều và phản ứng nhân gen đƣợc thực hiện với 30 chu kỳ gồm 3 bƣớc phản ứng: i) biến tính DNA ở 94oC trong 30 giây; ii) gắn mồi ở 56oC trong 45 giây; iii) kéo dài ở 72oC trong 45 giây. Sản phẩm PCR đoạn gen này đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và đƣợc chụp ảnh bằng hệ thống Geldoc. 2.3.3.3 Điện di DNA trên gel agarose
Gel agarose 1-2% đƣợc chuẩn bị trong đệm TAE với nồng độ EDTA 1-2 mM để tránh sự phân cắt DNA bởi nuclease. Mẫu DNA đƣợc trộn với đệm mẫu có chứa glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol xanh, xylene cyanol và ethidium bromide (EtBr) ở nồng độ 50 g/l và tra vào các đƣờng chạy trên gel. Quá trình điện di đƣợc thực hiện với hiệu điện thế ổn định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2 cm thì dừng lại. Bản gel đƣợc lấy ra và soi dƣới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp ảnh Geldoc.
60
2.3.3.4. Định lƣợng số bản copy của WSSV bằng kỹ thuật Real-time PCR.
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật Real-time PCR với chất phát huỳnh quang là SYBR Green I đƣợc sử dụng để đánh giá nồng độ virus. Thành phần của phản ứng real-time PCR đƣơ ̣c ghi ở bảng 2.3.
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng Real-time PCR
Thành phần Thể tích (μl)
H2O cất khử trùng, khử ion Đệm Taq DNA polymerase 10X
Taq DNA polymerase 5 u/μl dNTP 2 mM
SBRY I 10x
Mồi xuôi (Fw)10 pmol Mồi ngƣợc (Rv)10 pmol DNA khuôn (50ng) 14,0 2,5 0,5 2,5 2,5 1,0 1,0 1,0 Tổng thể tích 25
Real-time PCR đƣợc thực hiện với 30 chu kỳ gồm 3 bƣớc phản ứng: i) biến tính DNA ở 94oC trong 30 giây; ii) gắn mồi ở 56oC trong 45 giây; iii) kéo dài ở 72oC trong 45 giây. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm IQ5 Optical System.
2.3.4. Nhân dòng, biểu hiện VP28 trong E. coli và B. subtilis
2.3.4.1. Nhân dòng trực tiếp đoa ̣n gen mã hóa VP28 vào vector
Các sản phẩm của phản ứng PCR nhân bản đoạn gen vp28 từ các mẫu tôm nhiễm bệnh đốm trắng, sau khi đã kiểm tra trên gel agarose 2%, đƣợc gắn trực tiếp vào vector nhân dòng pGEM-T theo kit của Promega. Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm vào vector đầu T trên tổng thể tích 10 l nhƣ sau: 2 l sản phẩm PCR, 1 l đệm T4 DNA ligase 10X, 1 l T4 DNA ligase, 1 l vector đầu T, 5 l ddH2O. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 22oC trong 2-3 giờ hoặc 4 oC qua đêm và giữ ở -20oC cho đến khi biến nạp.
61
Tế bào khả biến E. coli chủng DH5 hoặc BL21 (bảo quản ở -80oC) đƣợc lấy ra để trên đá 10-20 phút cho tan dần. Hỗn hợp phản ứng gắn ở trên đƣợc bổ sung vào, trộn nhẹ và để trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào, sau đó đƣợc sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây và đƣợc chuyển ngay lên đá 2 phút. 300-500 l môi trƣờng LB lỏng đƣợc bổ sung vào hỗn hợp biến nạp. Mẫu sau đó đƣợc giữ trong tủ ấm 37oC trong 10 phút và lắc ở tốc độ 150 vòng/phút, 37o
C trong 50 phút. 50-100 l hỗn hợp biến nạp đƣợc cấy trải tế bào trên đĩa petri chứa môi trƣờng LB đặc có 50 g/ml ampicillin, 20 l X-gal 20 mg/ml và 20 l IPTG 100 mM và nuôi trong tủ ấm 37oC qua đêm.
2.3.4.2. Giải trình tự gen
Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hoá cho VP28 đƣợc pha loãng ở nồng độ thích hợp (khoảng 50-100 pmol) đƣợc dùng làm khuôn cho PCR trong xác định trình tự. Thành phần PCR cho xác định trình tự gồm: 6 l hỗn hợp DTCS (Dye terminator cycle sequencing) Master mix, 1 l khuôn, 1 l mồi, H2O vô trùng vừa đủ 20 l. Về cơ bản, PCR này có các thành phần giống nhƣ PCR thông thƣờng nhƣng có một số khác biệt là thêm sự có mặt của các ddNTP và chỉ cần dùng một loại mồi (mồi xuôi hoặc mồi ngƣợc). PCR đƣợc thực hiện nhƣ sau: 96o
C trong 1 phút để khởi động nóng tiếp theo là 35 chu kỳ gồm 3 bƣớc: 96oC trong 30 giây để làm biến tính DNA, 56oC trong 30 giây để gắn mồi, 60oC trong 4 phút để kéo dài chuỗi. Mẫu sau đó đƣợc ủ tiếp ở 60oC trong 7 phút và giữ ở 4oC cho đến khi phân tích.
Sản phẩm PCR này đƣợc tiếp tục xử lý trƣớc khi đƣa vào máy đọc trình tự. Quá trình xử lý mẫu gồm các bƣớc sau:
- Dung dịch dừng phản ứng (stop solution) đƣợc chuẩn bị ngay trƣớc khi dùng bao gồm: 20 l K-acetate 3 M, pH 5,2; 20 l EDTA 100 mM pH 8; 10 l glycogen và trộn đều. 5 l dung dịch dừng phản ứng đƣợc bổ sung vào mỗi ống sản phẩm PCR 20 l.
62
- 60 l ethanol 95% giữ ở -20oC đƣợc bổ sung vào hỗn hợp và trộn kỹ. Sau đó, hỗn hợp phản ứng đƣợc ly tâm ngay ở 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC. Dịch nổi đƣợc hút bỏ và thu kết tủa. Kết tủa đƣợc rửa 2 lần, mỗi lần bằng 200 l ethanol 70% giữ ở -20oC và đƣợc ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch nổi đƣợc hút bỏ, thu kết tủa và đƣợc để khô ở nhiệt độ phòng. Kết tủa đƣợc hoà tan trở lại bằng 40 l dung dịch SLS (sample loading solution). Mẫu sau khi xử lý đƣợc giải trình tự bằng hệ thống đọc trình tự.
2.3.4.3. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa VP28
Vector nhân dòng (pGEM T) tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa cho VP28 đƣợc xử lý với cặp enzyme giới hạn có trình tự cắt đã thiết kế thêm trên các cặp mồi để thu đƣợc đoạn gen mã hóa VP28 và cũng để tạo đầu tƣơng thích ở hai đầu đoạn gen. Đồng thời, vector biểu hiện cũng đƣợc xử lý cùng bằng cặp enzyme giới hạn với vector nhân dòng để tạo đầu dính tƣơng thích. Thành phần phản ứng cắt giới hạn bao gồm: 6 l đệm II 10X, 30 l vector, 2 l enzyme giới hạn, bổ sung dd H2O cho đủ 60 l.
Hỗn hợp phản ứng sau khi đƣợc hòa tan theo đúng tỉ lệ sẽ đƣợc ủ ở 37o
C qua đêm, tạo sản phẩm cắt hoàn toàn.
Sau khi cắt bằng enzyme giới hạn, đoạn gen mã hóa VP28 và đoạn vector biểu hiện dạng mạch hở đƣợc tinh sạch (bằng kit thôi gel của Bioneer). Theo quy trình này trƣớc tiên, sản phẩm cắt enzyme giới hạn cần đƣợc chạy trên gel agarose 1% để phân tách các băng. Sau đó, băng DNA khoảng 615 bp của đoạn gen mã hóa VP28 và vector biểu hiện dạng mạch hở với kích thƣớc phù hợp đƣợc thu nhận lại. 5 lần thể tích đệm GB (Gel Binding Buffer) đƣợc bổ sung vào 1 thể tích đoạn gel đã cắt. Hỗn hợp đệm và gel sau đó đƣợc đun ở 600C trong khoảng 10-15 phút để gel tan hết. Sau khi gel tan hoàn toàn, hỗn hợp phản ứng đƣợc đƣa lên cột thôi gel, cột sau đó đƣợc ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút, 4oC. Cột đƣợc rửa 2 lần bằng 500 l đệm rửa WB (Wash Buffer). Sau đó, DNA gắn trên cột đƣợc thu lại bằng cách bổ sung 30-60 l đệm rƣ̉a chiết EL (Elute Buffer). Cột đƣợc ly tâm ở
63
13.000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. DNA trong dịch ly tâm đƣợc thu nhận và giữ ở -20oC cho đến khi sử dụng.
Sau khi tinh sạch, đoạn gen mã hóa VP28 và vector biểu hiện đƣợc gắn với nhau nhờ enzyme nối T4 DNA ligase theo tỷ lệ đoạn gen và vector là 3:1, tổng thể tích phản ứng gắn 10-20 l. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 4oC qua đêm và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5. Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa thạch đƣợc sàng lọc bằng PCR trực tiếp, sau đó khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc lựa chọn để tách plasmid tái tổ hợp.
2.3.4.4. Dung hợp đoạn gen đích vào DNA hệ gen của B. subtilis chủng PY79 Thí nghiệm d ung hợp đoạn gen đích vào DNA hệ gen của B. subtilis chủng PY79 đƣợc thƣ̣c hiê ̣n nhƣ Harwood và tập thể mô tả trong [36]. Tế bào khả biến B. subtilis PY79 (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80oC) đƣợc lấy ra, giữ ở nhiệt độ phòng cho đến khi tan hoàn toàn. Ngay sau khi tế bào đƣơ ̣c giải đông, 2-4 μl DNA (vector pDG364-cotB-vp28 hoặc vector pDG364-cotB-gst-vp28 đã đƣợc tạo dạng mạch thẳng) đƣợc bổ sung vào ống, nuôi lắc ở 37o
C trong 30-45 phút. Một đối chứng âm đƣợc tiến hành song song cùng với mẫu trong đó DNA đƣợc thay thế bằng nƣớc đã khử trùng. Bƣớc tiếp theo, tế bào biến nạp đƣợc cấy trải lên đĩa chứa môi trƣờng thạch DSM có chọn lọc bằng chloramphenicol nồng độ 5 μg/ml, ủ ở 37oC qua đêm.
Sau quá trình biến nạp, các khuẩn lạc thu đƣợc sẽ đƣợc cấy chuyển sang đĩa môi trƣờng LB có bổ sung 1% tinh bột và nuôi ở 37oC qua đêm.
Về mặt lý thuyết, đoạn DNA đích gắn đƣợc vào hệ gen của B. subtilis nhờ quá trình trao đổi chéo giữa các đoạn tƣơng đồng,ở đây là đoạn amyE front và amyE back trên vector với trình tự amyE có trên DNA hệ gen của B. subtilis. Vì đoạn gen dung hợp nằm kẹp giữa 2 trình tự amyE front và amyE back của vector, nên đoạn gen dung hợp này sẽ chèn vào chính vị trí amyE của B. subtilis. Do vậy, B. subtilis
mang đoạn gen dung hợp cotB-VP28 sẽ mất khả năng sinh amylase. Đây cũng chính là cơ chế để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen dung hợp trong genome của B. subtilis. Các khuẩn lạc sẽ đƣợc chọn ngẫu nhiên và nuôi trên môi trƣờng LB có bổ sung 1% tinh bột. Kết quả là, khi kiểm tra bằng phƣơng pháp nhuộm màu iot
64
(I2/KI) đĩa nuôi cấy, khuẩn lạc nào tạo vòng phân giải tinh bột do amylase vẫn đƣợc sinh ra sẽ không mang đoạn gen đích, khuẩn lạc nào không có vòng sáng có nghĩa là đoạn gen dung hợp đã chèn vào DNA hệ gen thành công. Các khuẩn lạc không