1.2.1. Một số biện pháp phòng chống WSSV
1.2.1.1. Đáp ứng miễn dịch chống lại WSSV của tôm
Hệ thống miễn dịch của các động vật không xƣơng sống còn khá sơ khai và ít đƣợc nghiên cứu. Chúng chỉ mới có hệ miễn dịch tự nhiên còn gọi là miễn dịch bẩm sinh [37]. Tuy nhiên, có nhiều cơ chế miễn dịch sử dụng bởi động vật không xƣơng sống có khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh nhƣ: vi khuẩn, nấm và virus. Miễn dịch tự nhiên của tôm đƣợc kích hoạt khi nhận ra tác nhân gây bệnh liên quan đến mô hình phân tử (PAMPs) thông qua các thụ thể đặc hiệu (PRRS). Bƣớc nhận dạng này trực tiếp hoặc gián tiếp gây nên nhiều cơ chế bảo vệ khác nhau ở tôm một cách phức tạp để loại bỏ các tác nhân gây bệnh [88, 89]. Các đáp ứng miễn dịch tế bào bao gồm sự thực bào, hình thành hạch, đóng gói và chết theo chƣơng trình, trong khi phản ứng miễn dịch dịch thể bao gồm hệ thống prophenoloxidase, đông máu, những peptide kháng khuẩn, lectin, Dscam, con đƣờng Toll và IMD [98].
Đáp ứng miễn dịch tế bào của động vật không xƣơng sống đƣợc thực hiện bởi các tế bào máu (hemocyte) có mặt trong máu (hemolymph) của hệ tuần hoàn mở của tôm. Ba loại tế bào máu chính có thể đƣợc xác định trong hầu hết các loài giáp xác là các tế bào hyalin, các tế bào dạng bán hạt và các tế bào dạng hạt. Mỗi tế bào tham gia các sự kiện khác nhau nhƣ sự thực bào, chết theo chƣơng trình, đóng gói và hình thành hạch, sửa chữa vết thƣơng và đông máu. Bên cạnh sự tham gia của nó trong phản ứng của tế bào, các tế bào máu còn cung cấp các peptide kháng khuẩn khác nhau, lectin, chất ức chế proteinase và opsonin hóa nhƣ các peroxinectin protein kết dính tế bào [18].
Tác dụng chống virus của hemocyanin là đáp ứng miễn dịch bẩm sinh quan trọng chống lại WSSV do nó có khả năng làm chậm lại sự lây nhiễm và nhân lên của WSSV. Tuy nhiên, miễn dịch dịch thể của tôm chủ yếu bao gồm hệ thống hoạt hóa prophenoloxidase (proPO) có vai trò điều khiển quá trình melanin hóa tác nhân gây bệnh và các mô bị xâm hại, sự dính kết, sự thực bào, chết theo chƣơng trình cũng nhƣ việc sản sinh các peptide kháng virus, các thành phần gốc tự do oxy hóa
35
trung gian (ROI) và nitrơ hóa trung gian (RNI) [10, 46, 115]. Hình 1.10 là tóm tắt về hệ miễn dịch của tôm [98].
Hình 1.10: Sơ đồ của hệ thống miễn dịch ở tôm [98]
Sự đáp ứng miễn dịch ở tôm đƣợc thực hiện chính bởi các tế bào tạo máu chuyên hóa nhƣ thực bào, quá trình phong tỏa và sự sản sinh các peptide kháng khuẩn hay hoạt hóa phenoloxidase. Tế bào bạch cầu của giáp xác đƣợc chia thành 2 loại: bạch cầu không hạt (hyaline cell) và bạch cầu có hạt (granular cell). Đối với bạch cầu có hạt, trƣớc hết khi bị kích thích bởi β-glucan, quá trình tiêu giảm hạt (degranulation) sẽ xảy ra, từ đó dẫn đến sự phóng thích một số enzyme miễn dịch bao gồm prophenoloxidase (proPO), serine proteinase, peroxinectin (PX), và α2- macroglobulin (α2-M) [19]. Tiếp theo, với sự xúc tác của serine proteinase (SP) giống trypsin đƣợc biết có vai trò kích hoạt hệ thống proPO (proPO-activating (PPA) không hoạt động chuyển thành phenoloxidase (PO) hoạt động. PO là một enzyme chứa ion Cu2+, xúc tác tiếp theo 2 quá trình o-hydroxyl hoá monophenol và oxy hoá diphenol thành quinine. Chức năng quan trọng của PO là chuyển hợp chất tyrosine thành dihydroxyphenylalanine (DOPA) cũng nhƣ là DOPA-quinone, sau
36
đó quinone sẽ đƣợc trùng hợp thành melanine. Trong suốt quá trình melanin hóa, melanin sẽ bao lấy vi khuẩn hay vật lạ và phóng thích ra ngoài lớp vỏ cutin. Cơ chế này cũng giống nhƣ cơ chế miễn dịch của côn trùng, sắc tố melanin sẽ tích tụ trên vỏ giáp của giáp xác, đó cũng là bằng chứng của quá trình bị tổn thƣơng.
Song song với quá trình melanin hóa, các peptide kháng khuẩn bao gồm crustin, các yếu tố kháng lipopolysaccharide, penaeidin, lectin và lysozyme… cũng đƣợc tiết ra bởi bạch cầu có hạt để tiêu diệt mầm bệnh (Hình 1.11). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các β-glucan kích thích quá trình melanin hóa và quá trình thực bào thông qua sự nhận biết bởi các protein đặc biệt là PRPs (specific pattern-recognition proteins): LGBP (lipopolysaccharide và β-1,3-glucan-binding protein) và βGBP (β- glucan-binding protein) trên tế bào bạch cầu (Hình 1.11) [3, 52].
Hình 1.11: Cơ chế kích thích miễn dịch không đặc hiệu của tôm khi bị kích thích bởi β-glucan [3].
37
Ở tế bào bạch cầu có hạt sẽ xảy ra quá trình melanin hóa để bao lấy tác nhân gây bệnh và phóng thích ra ngoài lớp vỏ cutin; còn ở tế bào bạch cầu không hạt sẽ xảy ra quá trình thực bào. Trong quá trình thực bào này sẽ sinh ra các dạng oxy phản ứng bao gồm : gốc superoxide (O2.-), gốc hydroxyl (.OH) và peroxide hydro (H2O2) để tiêu diệt tác nhân gây bệnh, từ đó làm tăng hoạt tính của superoxide dismutase (SOD) nhằm cân bằng chuyển hóa các gốc tự do sang dạng không gây độc cho cơ thể tôm (Hình 1.11) [52]. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy khả năng làm tăng miễn dịch của tôm thông qua việc tăng hoạt độ của superoxide dismutase khi tôm đƣợc kích thích miễn dịch bởi β-glucan và hợp chất polysaccharide chứa lƣu huỳnh [96].
Để đánh giá đáp ứng miễn dịch ở tôm, ngƣời ta đã đánh giá hoạt độ một số enzyme trong hemolymph có liên quan đến đáp ứng miễn dịch bao gồm phenoloxidase (PO), superoxide dismutase (SOD), hay nitric oxide synthase cảm ứng (iNOS) [34, 86].
1.2.1.2. Các kết quả nghiên cứu về phòng chống WSSV
Vì chƣa có một phƣơng pháp nào điều trị hiệu quả bệnh đốm trắng nên về mă ̣t lâu dài thì chỉ có c ác phƣơng pháp phòng bê ̣nh đƣợc phát triển nhằm kiểm soát đƣơ ̣c di ̣ch bê ̣nh cho tƣ̀ng giai đoa ̣n sinh trƣ ởng của tôm. Thƣ̣c tế nuôi tôm cho thấy trong giai đoạn ƣơng trƣ́ng , viê ̣c thau rƣ̉a trƣ́ng và ấu trùng nên kết hợp với Iodiphor và dòng nƣớc chảy là một kỹ thuật để loại bỏ sạch WSSV khỏi thế h ệ con sau này. Tại những trang trại nuôi tôm , viê ̣c sàng lo ̣c hâ ̣u ấu trùng bi ̣ nhiễm WSSV trƣớc khi cung cấp cho các trang tra ̣i , nên tránh làm vào mùa la ̣nh và nê n sƣ̉ du ̣ng các phƣơng pháp sinh học để kiểm soát chất lƣợng nƣớc và hệ thống nuôi . Bệnh dịch có thể trở nên trầm trọng hơn bởi các yếu tố nhƣ thay đổi độ mặn và nhiệt đột ngô ̣t [55].
Theo nghiên cƣ́u của Jiravanichpaisal và tập thể [48], trong điều kiện thử nghiệm, tôm càng P. leniusculus không bị chết khi cảm nhiễm WSSV ở nhiệt độ 4 và 12oC, nhƣng khi tăng nhiệt độ lên (22oC), 100% số tôm này chết sau 12 ngày. Đáng chú ý là các loài nhiễm WSSV đƣợc giữ ở nhiệt độ 22oC trong vòng 5 ngày,
38
sau đó chia các mẫu ra nuôi ở nhiệt độ 22oC, 16oC, và 12oC. Tỉ lệ chết của tôm càng nhiễm WSSV ở 22oC là 100% sau 3 ngày, còn ở 16oC và 12oC để có 100% tôm bị nhiễm WSSV thì mất tƣơng ứng 20 và 35 ngày. Khi ở giai đoạn cấp tính, sự tăng nhiệt độ nƣớc dẫn đến tiến triển bệnh nhanh hơn và gây ra chết tôm nhiễm WSSV [48]. Sự thay đổi nhiệt độ nhƣ vậy có thể giúp cho ngƣời nuôi tôm có thêm thời gian để quản lý thu hoạch khẩn cấp.
Việc sử dụng các chế phẩm sinh học có thể giúp tăng cƣờng sức khỏe của tôm bằng cách ngăn cản sự xâm nhập của mầm bệnh và kích thích đáp ứng của hệ thống miễn dịch. Một đề xuất khác để tăng cƣờng hệ thống miễn dịch của tôm là sử dụng β-1,3/1,6-glucan. Tôm sú P. monodon ở, giai đoạn sau ấu trùng và con trƣởng thành khi đƣợc cho ăn thức ăn chứa β-1,3-glucan và đƣợc tiếp xúc với WSSV có thể sống đến 120 ngày, còn tất cả tôm đối chứng chết sau 4 ngày [20].
Một số sản phẩm nguồn gốc tự nhiên đƣợc thông báo là có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch để ngăn cản sự nhiễm virus. Một số thực vật có khả năng chống lại virus và chúng đã đƣợc sử dụng để điều trị các động vật (trong đó có tôm) nhiễm virus. Các nghiên cứu chủ yếu sử dụng dịch chiết thực vật để bảo vệ tôm chống lại sự nhiễm WSSV. Trong số các nghiên cứu gần đây, dịch chiết methanol của 5 loài thực vật có nguồn gốc Ấn Độ (Cỏ gà (Cynodon dactylon), Bầu nâu (Aegle marmelos), Rễ gió (Tinosporacordifolia), Picrorhiza kurooa và Nhọ nồi (Eclipta alba)) đã đƣợc trộn với tỉ lệ bằng nhau làm thức ăn cho tôm bị nhiễm WSSV bằng cách tiêm thực nghiệm. Sau 20 ngày, sự sống của các sinh vật đƣợc cung cấp thức ăn có dịch chiết thực vật có tỉ lệ cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng dùng thức ăn không có dịch chiết [24]. Trong nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng virus chống lại WSSV, 20 loài thực vật Ấn Độ đã đƣợc thử, trong số đó, 5 dịch chiết thực vật (Bầu nâu (Aegle marmelos), Cỏ gà (Cynodon dactylon), Ngũ sắc (Lantana camara), Mƣớp đắng (Momordica charantia), Diệp hạ châu (Phyllanthus amarus)) cho hoạt tính chống virus. Dịch chiết dạng nƣớc của C. dactylon cho thấy hoạt tính kháng WSSV mạnh nhất do không quan sát đƣợc trƣờng hợp chết nào cho đến khi kết thúc thí nghiệm ở ngày thứ 30 [11]. Cuối cùng hoạt tính kháng virus của thực vật Ấn Độ
39
cây Đậu dầu (Pongamia pinnata) chống lại WSSV đã đƣợc báo cáo và tỉ lệ sống sót lên đến 80% sau 15 ngày khi tôm đối chứng chết sau 6 ngày. Hơn nữa, 3 phân đoạn sắc ký chính đã thu đƣợc từ dịch chiết ethnol của lá cây Đậu dầu đã đƣợc trộn vào thức ăn và thí nghiệm với tôm đƣợc tiếp xúc với WSSV, đƣợc cho ăn 3 bữa/ngày và phân đoạn 2 cho thấy tỉ lệ sống sót hơn 50% sau 6 ngày so với phân đoạn 1 và 3. Phân tích chi tiết phân đoạn 2 xác định hợp chất kháng virus nhƣ bis (2- methylheptyl) phthalate [79]. Hợp chất này cũng đã phát hiện ở các thực vật khác nhƣng trƣớc đó chƣa đƣợc coi là chất kháng virus.
Sự phát triển vaccine giúp phòng bệnh đốm trắng do WSSV hoặc các tác nhân gây bệnh ở tôm không đƣơ ̣c quan tâm nhiều vì bản thân tôm chƣa có hệ thống miễn dịch ghi nhớ. Ngoài ra các hiểu biết về bệnh học ở tôm cũng còn hạn chế . Tuy nhiên, sự có mặt của đáp ứng miễn dịch chống lại WSSV đã đƣợc phát hiện trong tôm P. japonicus. Venegas và tập thể [110] đã chứng minh sự tồn tại của đáp ứng gần nhƣ miễn dịch ở P. japonicus đã bị lây nhiễm WSSV một cách tự nhiên và cả trong thử nghiệm. Trong nghiên cứu này, những con tôm sống sót vƣợt qua dịch bệnh đốm trắng tự nhiên đƣợc tái cảm nhiễm với WSSV sau 4 tháng và kết quả là tỷ lệ sống sót lên đến khoảng 94% [110]. Trong nghiên cứu theo sau đó, những con tôm sống sót khi thử nghiệm với WSSV có khả năng kháng lại WSSV khi tái lây nhiễm ở tuần thứ 3 và thứ 4, khả năng đề kháng tiếp tục tăng lên đến tháng thƣ́ hai. Từ những kết quả đó, ngƣời ta cho rằng các nhân tố trung hòa có mặt trong huyết thanh của những con tôm sống sót tham gia vào khả năng đề kháng chống lại WSSV [119]. Những kết quả này cũng thúc đẩy các nhà khoa học nghiên cứu về khả năng tạo vaccine giúp tôm chống lại WSSV [110], mặc dầu cũng có nhƣ̃ng ý kiến không đồng tình về viê ̣c sƣ̉ du ̣ng thuâ ̣t ngƣ̃ “vaccine” cho tôm khi mà chúng không có khả năng sinh ra kháng thể kháng la ̣i tác nhân gây bê ̣nh . Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy sự kháng virus đƣợc phát triển bởi các sinh vật sống sót là do một thành phần trung hòa WSSV ở trong plasma của tôm [119] và cho rằng đáp ứng miễn dịch thích nghi có thể tồn tại ở tôm. Tuy nhiên, bản chất của các nhân tố nhƣ thế này cần phải đƣợc điều tra thêm.
40
Trong số các nghiên cứu phòng bệnh đốm trắng trên tôm ở Việt Nam có thể kể đến công trình của Nguyễn Văn Hảo và tập thể [4]. Các tác giả đã xây dựng các biện pháp áp dụng để tạo môi trƣờng nuôi cấy “lý tƣởng” cho tôm giúp tăng cƣờng sức đề kháng đối với WSSV, trong đó một số phƣơng pháp cụ thể đƣợc áp dụng bao gồm:
- Chọn tôm bố mẹ có chất lƣợng tốt, không nhiễm WSSV. - Không vận chuyển tôm giống mật độ cao.
- Thức ăn tƣơi sống không hƣ thối và dùng nhiệt nấu chín.
- Hàng tháng cho tôm ăn thêm vitamin C từ 1-2 đợt với liều 2-3 g/1 kg thức ăn cơ bản, mỗi đợt cho tôm ăn một tuần liên lục.
- Nguồn nƣớc cấp cho ao nuôi tôm phải lắng lọc và khử trùng. - Vớt tôm chết ra khỏi ao.
- Ngăn chặn không cho tôm và giáp xác khác vào ao nuôi.
- Nƣớc ao nuôi tôm bị bệnh đốm trắng phải xử lý bằng chlorua vôi nồng độ cao (30-50g/m3), không đƣợc xả ra ngoài. Khi phát hiện bệnh, tốt nhất là thu hoạch ngay.
Nhìn chung lại, có thể nói rằng các nghiên cứu ở trong nƣớc theo hƣớng tìm ra giải pháp hiệu quả chống lại WSSV còn hạn chế và bệnh do WSSV gây ra vẫn là vấn đề thách thức đối với ngành nuôi tôm.
1.2.2. Protein VP28 và nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSV
VP28 là protein có nhiều nhất ở lớp vỏ WSSV, đóng vai trò chủ đạo giúp virus gắn đặc hiệu lên tế bào tôm (bƣớc khởi đầu cho quá trình lây nhiễm của virus). Cấu trúc của VP28 cũng tái khẳng định vai trò của VP28 là một protein gắn bám [124]. VP28 đƣợc mã hóa bởi gen wsv421 có khối lƣợng phân tử 27,5 kDa, lần đầu tiên đƣợc xác định là một protein vỏ với một vùng xuyên màng giả định ở tận cùng đầu N, 5 vị trí N-glycosyl hóa và 2 vị trí O-glycosyl hóa. Tuy nhiên, có một vùng kị nƣớc mạnh ở tận cùng đầu N của VP28, bao gồm cả vùng xuyên màng giả định [124]. Một số bằng chứng cho thấy VP28 liên quan trực tiếp đến tính chất lây
41
truyền của WSSV ở tôm. Chính cấu trúc của VP28 đã gợi ý rằng VP28 có thể đóng vai trò quan trọng là một protein xâm nhập.
Sự tƣơng tác của VP28 với các protein cấu trúc khác của WSSV cũng đã đƣợc nghiên cứu. Bằng việc sử dụng các phân tích miễn dịch đã cho thấy protein lớp vỏ nucleocapsid VP26 và VP24 đều bám vào VP28 [120]. Điều nổi bật ở đây là cả 3 loại protein cấu trúc này đều có mức độ tƣơng đồng cao về trình tự các nucleotide và acid amin, chứng tỏ chúng phát sinh từ chung một nguồn gốc và sau quá trình nhân lên của gen, chúng phân tách ra, tiến hóa theo các hƣớng thực hiện chức năng khác nhau. Cả ba loại protein này đều có một vài vùng bảo thủ chung, bao gồm các vùng kị nƣớc mạnh với chuỗi α-helix đóng vai trò nhƣ vùng gian màng và một vùng khác có khả năng liên quan đến các tƣơng tác trung gian giữa các protein [105]. Nhìn chung, các nghiên cứu đều chỉ ra rằng VP28 là một protein vỏ đa chức năng, không chỉ bám vào protein màng của tế bào chủ (từ đó làm trung gian trong quá trình xâm nhiễm của WSSV) mà còn tƣơng tác với VP24, VP26 để cố định lớp vỏ ngoài vào lớp tegument bên dƣới. Thêm vào đó, VP26 tƣơng tác với nucleocapsid [121].
Gần đây VP26 và VP28 đã đƣợc kết tinh và nghiên cứu sâu về cấu trúc không gian [97]. Cả hai loại protein này đều đƣợc cấu thành bởi các cấu trú c gấp nếp β, chúng thƣờng có đầu N nhô ra ngoài. Các nghiên cứu sâu hơn còn cho thấy các protein này ở lớp vỏ đều có cấu trúc dạng trimer. So sánh cấu trúc của hai loại protein này đã chỉ ra rằng chúng có chung nguồn gốc tiến hóa từ protein cấu trúc của loại virus khác, bao gồm protein lớp vỏ ngoài P3 của bacteriophage PRD1 hay protein vỏ hexon của adenovirus và một số loại protein khác. Dựa trên những đặc điểm cấu trúc này cùng với những bằng chứng từ những nghiên cứu trƣớc, Tang và tập thể [97] đã giả thiết rằng vùng đầu N xuyên màng của VP26 và VP28 đƣợc cố định trên lớp vỏ của virus. Bằng cách này mà cấu trúc lõi gồm các dải β lộ ra phía ngoài lớp vỏ giúp chúng có thể dễ dàng tƣơng tác với các thụ thể hoặc màng của tế