Đoạn gen mã hóa VP28 (615 bp), sau khi đƣợc nhân bản thành công bằng PCR, đƣợc gắn vào vector pGEM-T và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α, nuôi cấy trên môi trƣờng LB có bổ sung kháng sinh ampicillin 50 g/ml, với sự cảm ứng của IPTG (1 mM) và cơ chất X-gal.
Dựa trên màu sắc của các khuẩn lạc xuất hiện, ba khuẩn lạc trắng và một khuẩn lạc xanh đƣợc chọn ngẫu nhiên để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen nhân dòng bằng PCR sử dụng cặp mồi VP28.1 Fw/Rv của gen vp28 và cặp mồi pGEM.Fw và pGEM.Rv đặc hiệu cho vector pGEM. Theo tính toán lý thuyết, nếu vector có mang đoạn gen vp28 thì sản phẩm PCR thu đƣợc sẽ có kích thƣớc 863 bp, bao gồm đoạn gen vp28 615 bp và đoạn DNA 248 bp của vector pGEM.
Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR sử dụng DNA từ 3 khuẩn lạc trắng và 1 khuẩn lạc xanh làm khuôn (Hình 3.2) cho thấy sản phẩm PCR từ khuẩn lạc xanh cho băng DNA có kích thƣớc khoảng 250 bp (theo tính toán là 248 bp, đƣờng chạy 4) và các sản phẩm PCR từ khuẩn lạc trắng đều cho băng DNA có kích thƣớc khoảng 860 bp (theo tính toán là 863 bp,các đƣờng chạy 1-3).
Hình 3.2: Điện di gel agarose sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của vp28 trong các thể biến nạp sử dụng cặp mồi pGEM Fw/Rv và cặp mồi VP28.1 Fw/Rv
1-3: Sản phẩm PCR khuẩn lạc trắng (1 – 3) với cặp mồi pGEM Fw/Rv 4: Sản phẩm PCR khuẩn lạc xanh với cặp mồi pGEM Fw/Rv
75 5, 6: Mẫu đối chứng âm ( không có DNA khuôn) M: Thang chuẩn DNA 1kb
7: Sản phẩm PCR khuẩn lạc xanh với cặp mồi VP28.1 Fw/Rv
8-10: Sản phẩm PCR khuẩn lạc trắng 1-3 với cặp mồi VP28.1 Fw/Rv
Khi sử dụng PCR với cặp mồi đặc hiệu VP28.1 Fw/Rv (Hình 3.2) cho thấy, sản phẩm PCR từ khuẩn lạc trắng cho băng DNA kích thƣớc khoảng 615 bp đặc hiệu cho vp28 (đƣờng chạy 8-10); trong khi đó, với khuẩn lạc xanh không chứa đoạn gen quan tâm nên không cho băng này (đƣờng chạy 7). Nhƣ vậy, có thể bƣớc đầu kết luận rằng các khuẩn lạc trắng chứa plasmid tái tổ hợp mang gen vp28.
3.1.3. Xác định trình tự và nghiên cứu tính đa hình của gen mã hóa VP28
Để biết chính xác trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa cho VP28, chúng tôi đã tiến hành tách và tinh sạch plasmid tái tổ hợp (ký hiệu pGEM-vp28) từ các khuẩn lạc trắng và giải trình tự đoạn gen vp28 trong pGEM - VP28 thu đƣợc. Kết quả giải trình tự nucleptide của vp28 sau đó đƣợc so sánh với trình tự gen vp28 của Việt Nam (AY168644) đƣợc công bố trƣớc đó bởi Phan Thị Phƣợng Trang và tập thể [9]. Kết quả phân tích (Hình 3.4) cho thấy, trình tự vp28 của WSSV thu nhận đƣợc từ các tỉnh Sóc Trăng, Ninh Thuận, Cam Ranh (1.2), Khánh Hòa và Cần Giờ (1, 4, 7, 9, 10) ở thành phố Hồ Chí Minh là hoàn toàn trùng khớp với trình tự vp28
đƣợc công bố (AY168644). Trong khi đó, tại vị trí nucleotide 125 của vp28 có 13/23 mẫu thu nhận đƣợc từ Bến Tre, Bình Định (1), Điền Hƣơng (1, 2), Phong Hải ở Huế, Cần Giờ (2, 3, 5, 6, 8) ở thành phố Hồ Chí Minh, Kiên Giang, Hải Phòng, Trà Vinh là có sự khác biệt so với trình tự vp28 AY168644 (A đƣợc thay bằng G). Ngoài ra trình tự vp28 từ Bình Định (2) có sự khác biệt nucleotide ở vị trí thứ 403 (A403G), đặc biệt trình tự vp28 của mẫu Cần Giờ (2) ở thành phố Hồ Chí Minh có 4 sự khác biệt nucleotide ở vị trí thứ 125 (A125G), 183(A183G), 226(A226G) và 517(T517C) so với trình tự vp28 AY168644.
Khi so sánh trình tự acid amin suy diễn của protein mã hóa của 23 trình tự gen vp28 và gen vp28 (AY168644) của Việt Nam đã công bố (Bảng 3.2) cho thấy, các trình tự vp28 từ Bến Tre, Bình Định (1), Điền Hƣơng (1, 2), Phong Hải ở Huế
76
Cần Giờ (2, 3, 5, 6, 8) ở thành phố Hồ Chí Minh, Kiên Giang, Hải Phòng, Trà Vinh có sự khác biệt về một gốc acid amin ở vị trí 42 (D42G) và trình tự Bình Định (2) có sự khác biệt về một gốc acid amin ở vị trí 135 (T135A), trong khi đó trình tự Cần Giờ (2) ở thành phố Hồ Chí Minh có 3 sự khác biệt về acid amin ở vị trí 42 (D42G), 76 (T76A), 173 (C173R).
Gen vp28 của WSSV phân lập đƣợc ở Indonesia, Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Hà Lan, Brazil, Mexico v.v... đã đƣợc nhân dòng và giải trình tự [13]. Khi so sánh trình tự vp28 phân lập ở Brazil với các nƣớc, nghiên cứu của Braunig [13] chỉ ra rằng trình tự DNA của gen vp28 phân lập đƣợc ở Brazil tƣơng đồng 98-100% với những trình tự công bố ở Ấn Độ (DQ681069; DQ013881; DQ013882; DQ013883), Hàn Quốc (AY324881), Nhật Bản (AY249443), Indonesia (AY249441) và Trung Quốc (AY249440). Tuy nhiên, trình tự này chỉ tƣơng đồng 90% với trình tự vp28 của Mexico (EU931415). Ngoài ra, nghiên cứu của Phan Thị Phƣợng Trang và tập thể [9] cho thấy trình tự gen vp28 WSSV thu nhận ở tỉnh Sóc Trăng, Việt Nam (AY168644) hoàn toàn tƣơng đồng với 10 trình tự vp28 khác của Nhật Bản, Indonesia, Hà Lan, Trung Quốc. Tuy nhiên, có sự sai khác 1 nucleotide ở vị trí 119 so với trình tự vp28 của Trung Quốc (AF502435) và 1 nucleotide ở vị trí 443 với với Hàn Quốc (AF380842) [9].
77
Hình 3.3: So sánh mức độ tƣơng đồng giữa trình tự nucleotide của gen vp28 từ các mẫu WSSV thu thập đƣợc và trình tự vp28 Việt Nam đã công bố trƣớc đây
78
Bảng 3.2: Một số sai khác về trình tự nucleotide và acid amin của VP28 thu nhận tại Việt Nam so với trình tự đã công bố (AY168644)
Tên mẫu Sai khác
nucleotide
Sai khác ở mức acid amin suy diễn
Sóc Trăng, Ninh Thuận, Cam Ranh 1.2 Khánh Hòa và Cần Giờ 1, 4, 7, 9, 10 ở thành phố Hồ Chí Minh
Bến Tre, Bình Định 1 (2011), Điền Hƣơng 1, 2, Phong Hải ở Huế Cần Giờ 2,3,5,6,8 ở thành phố Hồ Chí Minh, Kiên Giang, Hải Phòng, Trà Vinh
A125G D42G
Bình Định 2 A403G T135A
Cần Giờ 2
A125G D42G
A183G T76A
A226G
T517C C173R
Nghiên cứu của Wang và tập thể [113] cho thấy các vị trí quyết định kháng nguyên của VP28 là tƣ̀ các acid amin 28 đến 67, 87 đến 93 và 171 đến 204. Do đó 2 sai khác ở vị trí nucleotide 125 (A125G) dẫn đến sự thay thể aspartic bằng glycine (D42G) và ở vị trí nucleotide 517 (T517C) dẫn đến sự thay thể cysteine bằng arginine (C173R) của các mẫu thu đƣợc từ Bến Tre, Bình Định (1), Huế và Cần Giờ (2) ở thành phố Hồ Chí Minh là những sai khác trong vị trí quyết định kháng nguyên của VP28 và rất cần đƣợc quan tâm trong các nghiên cứu tiếp theo. 3 trong số 23 trình tự gen vp28 có những khác biệt đáng lƣu ý với các ký hiệu 05VN.VP28.HCM2.12, 06VN.VP28.BD1.11, 07VN.VP28.BD2.12 đã đƣợc chúng tôi đăng ký trên GenBank với các mã số (accession number) tƣơng ứng là JX444992.1, JX444993.1 và JX444994.1.
79
3.2. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA VP28
Mục tiêu chính của phần nghiên cứu này là tạo đƣợc bào tử B. subtilis tái tổ hợp có biểu hiện gen mã hóa cho VP28 trên bề mặt. Tuy vậy, để có protein tái tổ hợp VP28, chúng tôi đã đồng thời nghiên cứu biểu hiện gen vp28 trong E. coli và trên bề mă ̣t bào tƣ̉ B. subtilis.
Trình tự gen mã hóa VP28 thu đƣợc từ tôm bị nhiễm virus đốm trắng thu nhận từ Sóc Trăng (có trình tự trùng với trình tự AY168644 trong GenBank) đã đƣợc chọn cho các nghiên cứu tạo các thể tái tổ hợp.
3.2.1. Biểu hiện VP28 bằng hệ thống vector pET28b trong E. coli
Hệ thống vector pET đƣợc xem là một trong các hệ thống vector mạnh nhất cho biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn hiện nay. Các gen đích khi đƣa vào vector pET đƣợc điều khiển phiên mã bằng promoter T7 của thực khuẩn thể cùng với T7 RNA polymerase; protein đích có thể đƣợc biểu hiện tới hơn 50% protein tổng số của tế bào chỉ sau vài giờ cảm ứng. Vector pET28b có một trình tự 6 gốc histidine (6xHis) ở phía trƣớc của vùng nhân dòng đa điểm cắt (MCS) và một trình tự 6x His nữa ở đầu cuối C ngay trƣớc mã kết thúc, là cơ sở để tạo protein tái tổ hợp gắn với 6xHis, thuận tiện cho quá trình tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực.
Vector tái tổ hợp đƣợc ký hiệu là pGEM - vp28 và đƣợc tách ra ở dạng tinh sạch đƣợc dùng làm khuôn cho PCR. Cặp mồi đặc hiệu (VP28.2 Fw/Rv) dùng để gắn gen vp28 vào vector pET28b đƣợc thiết kế dựa trên trình tự nucleotide hai đầu của gen vp28 có đƣa vào thêm trình tự nhận biết của BamHI ở đầu và HindIII ở cuối để thuận tiện cho ghép gen vào vector pET28b về sau.
Bƣớc đầu tiên, cả 2 vector pGEM-vp28 và pET28b đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn HindIII và BamHI, sản phẩm của phản ứng cắt bằng enzyme đƣợc tinh sạch và điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di (Hình 3.4) cho thấy, vector pET28b khi đƣợc cắt bằng HindIII và BamHI cho một băng DNA với kích thƣớc 5,4 kb, đoạn gen vp28, sau khi cắt từ pGEM-vp28 cho một băng DNA có kích thƣớc khoảng 615 bp. Các kết quả này đúng nhƣ tính toán lý thuyết.
80
Đoạn gen vp28 sau đó đã đƣợc gắn vào vector biểu hiện pET28b bằng T4 ligase để tạo vector tái tổ hợp pET28b-vp28 và biến nạp vào chủng E. coli BL21- RIL. 6 khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng LB-kanamycin đƣợc chọn để PCR kiểm tra với cặp mồi của vector T7Fw/Rv và mồi của đoạn gen vp28 (VP28.2 Fw/Rv), sản phẩm PCR sau đó đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả thu đƣợc (Hình 3.5) cho thấy cả 6 khuẩn lạc đều cho băng DNA nhân bản có kích thƣớc khoảng 863 bp với mồi T7Fw/Rv và băng nhân bản 615 bp với mồi VP28.2 Fw/Rv.
Hình 3.4: Điện di gel agarose sản phẩm cắt vector biểu hiện và vector nhân dòng mang gen
vp28 bằng enzyme giới hạn sau
khi tinh sạch
1: vector pET28b 2: gen vp28 M: marker 1kb
Hình 3.5: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen vp28 trong các khuẩn lạc
M : Thang chuẩn DNA 1kb
1-6: Khuẩn lạc (1-6) PCR với mồi T7 Fw/Rv 6-14: Khuẩn lạc(1-6) PCR với mồi VP28 Fw/Rv 7, 8: Đối chứng âm (không chƣ́ a DNA khuôn)
81
Vector tái tổ hợp pET28b-vp28 sau đó đã đƣợc tách ra, tinh sạch và giải trình tự đoạn gen vp28, sử dụng cặp mồi T7Fw/Rv. Kết quả đọc trình tự (không trình bày ở đây) khẳng định chắc chắn gen vp28 đã đƣa đƣợc gắn vào vector pET28b đúng chiềuvà vị trí khung đọc.
Dịch chiết protein tổng số, dịch hòa phân đoạn tủa tế bào và dịch đồng nhất tủa tế bào sau đó đều đƣợc đƣa về hàm lƣợng protein tổng số nhƣ nhau là 1 mg/ml và đƣợc kiểm tra bằng SDS-PAGE và thẩm tách miễn dịch. Kết quả biểu hiện gen
vp28 đƣợc kiểm tra bằng SDS-PAGE và thẩm tách miễn dịch (Hình 3.6) cho thấy dịch chiết tế bào BL21-RIL mang vector pET28b-vp28 có chứa băng protein 28 kDa (đƣờng chạy 7, 8, 9, Hình 3.6A). Trong khi đó, ở mẫu đối chứng âm (tế bào BL21-RIL không mang vector pET28b-vp28) không có băng protein này. Kết quả thẩm tách miễn dịch, sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng VP28 cũng cho thấy sự có mặt của băng protein 28 kDa ở các mẫu tƣơng ứng với mẫu trên SDS-PAGE (đƣờng chạy 7, 8, 9, Hình 3.6B). Từ đó, chúng tôi kết luận rằng đã biểu hiện đƣợc VP28 ở E. coli.
Hình 3.6: SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu hiện VP28 ở E. coli
1: Dịch đồng nhất tủa tế bào BL21- RIL
- 7: Dịch đồng nhất tủa tế bào BL21-RI mang pET28b-vp28
82 2: Dịch chiết protein tổng số tế bào
BL21-RIL
- 8: Dịch chiết protein tổng số tế bào BL21- RIL mang pET28b-vp28
3: Dịch hòa phân đoạn tủa tế bào BL21-RIL
- 9: Dịch hòa phân đoạn tủa tế bào BL21-RIL mang pET28b-vp28
5: Thang chuẩn protein
Dịch chiết tế bào có chứa protein VP28 (dƣới dạng VP28-Histag) sau đó đƣợc tinh sạch bằng cách cho sắc ký qua cột His-bind. Phân đoạn protein tổng số sau khi gắn lên cột sẽ đƣợc rửa nhiều lần trong đệm A có chƣ́a Imidazol 5 mM, 80 mM và 100 mM nhằm loại bỏ các protein gắn không đặc hiệu với cột His-bind. Protein gắn cột đƣợc rƣ̉a chiết bằng đệm A có nồng độ Imidazol 250 mM và điện di SDS-PAGE cũng nhƣ thẩm tách miễn dịch sƣ̉ du ̣ng kháng thể đơn dòng kháng VP28 để nhận biết và kiểm tra độ tinh sạch.
Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của protein VP28 (Hình 3.7A) cho thấy việc sử dụng cột His-bind để tinh sạch protein VP28 thu đƣợc hiệu quả tốt bởi vì hầu hết các thành phần protein phức tạp bị loại bỏ hết. Trong các phân đoạn tinh sạch, chúng tôi chỉ thu đƣợc một băng protein có kích thƣớc khoảng 28 kDa, tƣơng ứng với kích thƣớc của protein VP28. So sánh kết quả thẩm tách miễn dịch (Hình 3.7B) với kết quả SDS-PAGE cho thấy những băng protein xuất hiện trên màng PDVF có cùng kích thƣớc 28 kDa với các phân đoạn tinh sạch khi điện di SDS-PAGE cho phép chúng tôi khẳng định đã tinh sạch thành công protein VP28. Kết quả định lƣợng protein cho thấy từ 100 ml dịch nuôi cấy, chúng tôi đã thu đƣợc tổng số 1,26 mg protein VP28. Protein tinh sạch sẽ đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng trong các nghiên cứu về biểu hiện trên bề mặt bào tử tiếp theo.
83
Hình 3.7: SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra độ tinh sạch của VP28
1: Dịch chiết tế bào có chứa protein VP28 lên cột His-bind 2: Dịch rửa cột His-bind bằng đệm A có imidazol 5 mM
3: Dịch rửa chiết cột His-bind bằng đệm A có imidazol 80 mM 4: Dịch rửa chiết cột His-bind bằng đệm A có imidazol 100 mM 5: Thang chuẩn protein
6-9: Dịch rửa chiết cột His-bind bằng đệm A có imidazol 250 mM
Ngay từ khi WSSV đƣợc phát hiện, protein VP28 tái tổ hợp (rVP28) đã đƣợc nghiên cứu biểu hiện ở nhiều hệ thống khác nhau. VP28 đã đƣợc biểu hiện thành công ở E. coli. Năm 2004, Sathish và tập thể [85] đã công bố kết quả biểu hiện thành công VP28 ở E. coli BL21 (DE3) sử dụng vector biểu hiện pREST B. Protein tái tổ hợp VP28 đƣợc cảm ứng biểu hiện bằng IPTG sau đó đƣợc tinh sạch nhờ cột sắc kí ái lực trong điều kiện biến tính sử dụng ure 8 M. Witteveldt và tập thể [114] đã biểu hiện thành công VP28 gắn đuôi histidine (Histag) trên vector pET28 trong E. coli. Jha và Xu [44] đã nhân dòng gen mã hóa cho VP28 thu đƣợc từ tôm nhiễm WSSV tại Trung Quốc bằng vector pUCm-T và pET-30a (+) trong E. coli BL21. Các tác giả đã chứng minh rằng bằng việc sử dụng hệ thống biểu hiện này có thể dễ dàng thu đƣợc một lƣợng lớn protein tinh sạch. Các nghiên cứu đã chỉ ra hƣớng sử
84
dụng protein tái tổ hợp nhƣ một vaccine qua đƣờng uống để tăng cƣờng khả năng bảo vệ tôm đối với virus đốm trắng.
Ngoài ra, Hou và tập thể [38] cũng nhân dòng và biểu hiện thành công gen mã hóa VP28 sử dụng vector pET30a ởg E. coli BL21. Sau khi cảm biến, protein VP28 tái tổ hợp đƣợc tinh sạch và dùng gây miễn dịch ở chuột để tạo kháng thể đơn dòng. Kháng thể đơn dòng đặc hiệu với rVP28 có khả năng nhận biết các VP28 của WSSV. Đồng thời, các tác giả cũng sử dụng kháng thể này trong phân tích dot-blot để phát hiện sự xâm nhiễm tự nhiên của WSSV. Cũng với mục đích của nghiên cứu là sử dụng protein VP28 để sản xuất kháng thể đơn dòng phục vụ việc chẩn đoán sự có mặt của WSSV. Nhóm nghiên cứu của Phan Thị Phƣợng Trang và tập thể [9] đã biểu hiện thành công protein VP28 tái tổ hợp ở E. coli dƣới dạng VP28-Histag và VP28-GST sử dụng hai vector biểu hiện là pQE39 và pGEX-2TK tƣơng ứng. Các tác giả cũng đã tinh sạch đƣợc 1,82 mg rVP28 từ 1 lít dịch nuôi cấy sử dụng cột Ni- NTA agarose.
3.2.2. Biểu hiện VP28 dạng dung hợp với protein CotB trên bề mặt bào tử B. subtilis subtilis
Gần đây plasmid (pDG364) đã đƣợc xây dựng bở i Stragier [36] để đƣa các gen quan tâm vào hê ̣ gen của B. subtillis thông qua trao đổi chéo tƣơng đồng ở vùng locus amyE. Những đặc nổi bật nhất của plasmid này là: có phần trƣớc và sau locus
amyE (amyE front và amyE back), gen cat chọn lọc CmR ở B. subtillis, bla (kháng ampicillin) và điểm khởi đầu sao chép ở E. coli, ba vị trí cắt giới hạn duy nhất (EcoRI, HindIII và BamHI) để nhân dòng đoạn DNA mong muốn, một vài vị trí cắt giới hạn để làm thẳng plasmid.
Plasmid pDG364-cotB, pDG364-cotB-gst đƣợc tạo thành từ plasmid pDG364 có gắn thêm gen cotB, cotB-gst ở vị trí enzyme giới hạn BamHI, HindIII. Việc dung hợp thêm protein GST (26 kDa) có thể làm tăng khả năng bộc lộ của