Hội chứng đốm trắng xuất hiện ở nhiều động vật giáp xác (trong đó có tôm). Ở tôm, bệnh có thể xuất hiện từ giai đoạn tôm giống đến tôm trƣởng thành. Mức độ nhiễm bệnh phụ thuộc vào tuổi tôm và các yếu tố môi trƣờng nhƣ: nhiệt độ, độ mặn, các bệnh do vi khuẩn, ô nhiễm môi trƣờng... Bệnh đốm trắng có thể lây truyền theo chiều dọc tức là từ bố mẹ truyền sang tôm con. Hoặc bệnh lây truyền theo chiều ngang tức là lây lan trực tiếp từ nƣớc qua các vết thƣơng tổn, qua các tế bào biểu mô che phủ trên mang hay qua niêm mạc ống tiêu hóa khi tôm ăn giáp xác nhỏ có mang bệnh [6].
Tôm bị nhiễm bệnh thƣờng có những dấu hiệu đặc trƣng nhƣ: xuất hiện nhiều đốm trắng ở dƣới vỏ ở vùng mang và đốt cuối thân (Hình 1.9), đôi khi toàn thân tôm có màu đỏ, hồng, nhợt nhạt, bỏ ăn, bơi vật vờ không định hƣớng, bơi lên mặt nƣớc hoặc dạt vào bờ. Khi xâm nhập vào tôm, WSSV cƣ trú ở nhiều bộ phận của tôm nhƣ mô dạ dày, mang, trứng, mắt, chân bơi… Các virus này nhân lên rất nhanh làm tôm nhiễm bệnh nặng và sau đó tiếp tục phát tán ra môi trƣờng bên ngoài, gây bệnh cho cả đàn tôm có trong ao. Tôm nhiễm WSSV thƣờng phát bệnh và chết vào khoảng 45-60 ngày sau khi thả nuôi, 3-10 ngày sau khi xuất hiện các đốm trắng, tôm chết hàng loạt và tỷ lệ chết của tôm nhiễm WSSV là 100% [6, 60].
Hình 1.9: Tôm sú bị bệnh đốm trắng, dƣới vỏ đầu ngực thấy rõ các đốm trắng [6].
29
Trong những năm gần đây bệnh đốm trắng thƣờng xuyên xuất hiện trong các khu vực nuôi tôm ven biển ở Việt Nam. Tại hầu hết các tỉnh, khi bị nhiễm bệnh đốm trắng, tôm chết hàng loạt và gây tổn thất lớn. Thời gian xuất hiện bệnh thƣờng là vào mùa Xuân và đầu Hè khi nhiệt độ trong ngày biến thiên quá lớn (> 5oC) gây sốc cho tôm. Năm 2001, theo điều tra của Bùi Quang Tề và tập thể trên 483 hộ nuôi tôm sú thuộc 23 huyện của 8 tỉnh ven biển phía Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh) thì có các bể nuôi tôm của 166 hộ (34,37%) đã bị nhiễm bệnh đốm trắng và tôm chết. Tôm sú nuôi sau 1-2 tháng thƣờng dễ bị nhiễm bệnh đốm trắng và chết hàng loạt [6]. Trong đầu năm 2010, tại Thanh Hóa, bệnh đốm trắng bùng phát trên cánh đồng nuôi tôm sú rộng 183 ha, gây thiệt hại 7,2 tỉ đồng. Trong năm 2010, bệnh đốm trắng cũng đã tràn lan khắp các tỉnh nhƣ Hà Tĩnh, Nghệ An và Thanh Hóa, gây thiệt hại nghiêm trọng cho các hộ nuôi tôm. Đầu năm 2011, bệnh đốm trắng đã gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến năng suất tôm nuôi ở các tỉnh Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà Mau, Kiên Giang ven biển Đồng bằng sông Cửu Long [8].
Bệnh đốm trắng xuất hiện ở nhiều động vật giáp xác tự nhiên nhƣ các loài tôm he, tôm nƣớc ngọt, cua, tôm hùm, chân chèo và ấu trùng côn trùng (Bảng 1.3) do đó bệnh lây lan rất nhanh trong các đầm nuôi tôm.
Bệnh đốm trắng lây truyền theo chiều ngang là chính. Virus lây từ các giáp xác khác (tôm cua, chân chèo) nhiễm bệnh đốm trắng từ môi trƣờng bên ngoài ao hoặc ngay trong ao nuôi tôm. Các con tôm khoẻ, khi tiếp xúc với tôm bị bệnh đốm trắng, dẫn đến bệnh lây lan càng nhanh hơn. Có thể một số loài chim nƣớc đã ăn tôm bị bệnh đốm trắng từ ao này và mang theo các mẩu thức ăn thừa vào các ao nuôi khác. Bệnh đốm trắng không có khả năng lây truyền qua đƣờng thẳng, tức là các noãn bào (trứng) phát hiện chúng nhiễm virus đốm trắng thì chúng không chín (thành thục) đƣợc. Nhƣng trong quá trình đẻ trứng của tôm mẹ có thể thải ra các virus đốm trắng từ trong buồng trứng của chúng, do đó ấu trùng tôm dễ dàng nhiễm virus ngay từ giai đoạn sớm.
30
WSSV có phạm vi vật chủ rộng, nhanh chóng phổ biến trên toàn thế giới và gây thiệt hại lớn. Vì vậy, đã có nhiều nghiên cứu tập trung để ngăn chặn và kiểm soát WSSV, các kết quả nghiên cứu này đã cung cấp nhiều thông tin về cơ chế phân tử của quá trình lây nhiễm và nhân lên của virus. Bằng phƣơng pháp gây nhiễm WSSV qua đƣờng miệng cho tôm, cho thấy trong giai đoạn đầu của quá trình lây nhiễm, virus đốm trắng xâm nhập vào dạ dày, mang, biểu bì, những mô liên kết của gan tụy. Ở giai đoạn sau đó là cơ quan bạch huyết, tuyến anten, mô cơ, mô tạo máu, tim, đoạn ruột sau và một số phần của ruột giữa. Hệ thần kinh và những cặp mắt kép chỉ bị nhiễm ở giai đoạn cuối [1].
Bảng 1.3: Một số giáp xác nhiễm bệnh đốm trắng [35] Vật nuôi Nhiễm tự nhiên (N)/ nhiễm thực nghiệm (E)
Phƣơng pháp kiểm tra Bệnh truyền nhiễm của tôm sú penaeus monodon H & E Kính HVĐT In situ PCR Họ tôm he
Penaneus chinensis_tôm nƣơng N
Penaneus dourarum E + + +
Penaneus indicus N +
Penaneus japonicus_tôm he
Nhật Bản N +
Penaneus merguiensis_tôm
bạc, lớt, thẻ N + + + + +
Penaneus monodon_tôm sú N + + +
Penaneus penicillarus N + + + + +
Penaneus semisulcatus_tôm thẻ N + +
Penaneus setiferus E + +
Penaneus stylirostris E +
Penaneus vannamei_tôm chân
31
Tôm khác
Exopalaemon orientalis N + + +
Macrobrochium
rosenbergi_tôm càng N +/- + +
Metapenaeus ensis, tôm rảo, chì N + + +
Palaemon styliferus N + + + Alpbeus brevieristatus N + Alpbeus lobidens N + Palaemon serrifer N + Cua Calappa lophos E + Charybdis feriata N + + + Charybdis natotor N + Charybdis japoncia N + Hemigrapsus sanguineus N + Helice tridens N + Mantura sp. N + Petrolistbes japonius + Potunus trituberculatus N +
Potumus pelagicus_ghẹ xanh N + + + + +
Scylla serrata_cua bể N + + + +
Sesarma sp. N + + + + + Somannia-tbelpusa sp. E + + + Mangrove crab N + + Thalamita sp. N + + + + Tôm hùm Panulirus longipes E + Panulirus arnatus E + Động vật thủy sinh khác Copepoda N + Ấu trùng côn trùng N +
32
Nghiên cứu xây dựng mô hình thực nghiệm chuẩn gây bệnh đốm trắng trên tôm sú của Nguyễn Văn Hảo và tập thể [4] cho thấy, khi nhiễm virus đốm trắng cho tôm bằng cách tiêm vào cơ, sau 12 giờ, cơ quan đầu tiên cho thấy sự có mặt của virus là tim, sau đó là tuyến anten, thực quản, dạ dày, mang và biểu mô dƣới vỏ (12- 21 giờ sau khi nhiễm), tiếp đến là mô liên kết, gan (21-24 giờ sau khi tiêm) và cuối cùng là ruột giữa, các cơ quan có nguồn gốc là trung bì nhƣ mô tạo máu, lympho. Các cơ quan đích của virus đốm trắng là mang, biểu mô, dƣới vỏ, thực quản, dạ dày, tuyến anten, cơ quan lympho và mô tạo máu. Cũng đã có một số nghiên cứu về đặc trƣng bộ gen và hình thái virus gây bệnh đốm trắng phân lập tại các vùng Hà Nội, Long An, Kiên Giang và Cà Mau của Nguyễn Viết Dũng và tập thể [2] và kết quả cho thấy chủng virus có nguồn gốc từ một ổ dịch ở Long An có kích thƣớc 60x350 nm và trình tự vật liệu di truyền vùng OPF75, 94 và 125 rất khác biệt về số lần lặp lại của các tiểu đơn vị so với chủng WSSV phân lập từ Cà Mau, Kiên Giang. Đỗ Thị Thanh Hƣơng và tập thể [25, 26] cũng đã công bố một số kết quả nghiên cứu về ảnh hƣởng của môi trƣờng và hóa chất đến thay đổi sinh lý, sinh hóa của tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii), và trao đổi chất của các loài tôm này. Nghiên cứu cho thấy ở độ mặn 0‰ và 15‰ khối lƣợng cơ thể của tôm tăng lên tƣơng ứng là 2,6 và 2,3 lần khối lƣợng cơ thể tôm ban đầu sau 4 tháng thả nuôi. Trong khi các nhóm nuôi ở độ mặn 25‰ tăng trƣởng thấp, tỷ lệ tử vong cao và một tần số lột xác thấp hơn đáng kể. Kết quả cho thấy tôm càng xanh có thể đƣợc nuôi trong nƣớc lợ lên đến 15‰. Trần Thị Tuyết Hoa [100] đã ứng dụng phƣơng pháp PCR-genotyping (ORF94) để phát hiện các chủng WSSV gây bệnh đốm trắng trên tôm sú. Tuy nhiên, cho đến nay, cơ chế xâm nhập và nhân lên trong tế bào tôm của WSSV vẫn chƣa đƣợc hiểu một cách kỹ lƣỡng.
1.1.5. Chẩn đoán WSSV
Kết hợp với dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng đã đƣợc mô tả ở hình 1.9, mầm bệnh đốm trắng có thể phát hiện bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau: PCR lai DNA in situ, Dot blot, phân tích miễn dịch, mô học v.v…[5, 87, 94]. Trong đó PCR
33
là kỹ thuật chẩn đoán nhanh, nhạy và có tính đặc hiệu cao. Kỹ thuật này đã đƣợc nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và phát triển, đồng thời đƣa ra các cải tiến mới nhƣ: Nested PCR, Semi - Nested PCR, Real-time PCR. Hiện nay quy trình Nested PCR của Lo và tập thể [63] là đƣợc sử dụng phổ biến trong chẩn đoán WSSV. Trong quy trình này, các tác giả sử dụng các cặp mồi 146Fl: 5' ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT AG 3' (mồi xuôi), 146Rl: 5' TAA TGC GGG TGT AAT GTT CTT ACG A 3' (mồi ngƣợc), 146F2: 5' GTA ACT GCC CCT TCC ATC TCC A 3' (mồi xuôi), và 146R2:5'TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT 3' (mồi ngƣợc). Với độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao kết hợp với khả năng phát hiện và định lƣợng đồng thời, Real-time PCR đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp rất có ý nghĩa trong việc xác định chính xác mức độ nhiễm mầm bệnh, đặc biệt là bệnh đốm trắng trên tôm. Tuy nhiên phƣơng pháp PCR và hóa mô miễn dịch đều là những phƣơng pháp chỉ có thể đƣợc thực hiện trong các phòng thí nghiệm đƣợc trang bị hiện đại và mất nhiều thời gian do phải trải qua nhiều công đoạn nhƣ nghiền, tách DNA từ mẫu, thời gian cho phản ứng PCR (riêng phƣơng pháp hóa mô miễn dịch phải mất tới 3-4 ngày). Nhằm khắc phục nhƣợc điểm của hai phƣơng pháp nói trên, những dạng que thử nhanh WSSV theo nguyên lý của phƣơng pháp miễn dịch đã đƣợc ra đời sử dụng kháng thể đơn dòng kháng lại một số protein vỏ nhƣ VP19, VP28 để phát hiện sớm virus gây bệnh [87, 94]. Với phƣơng pháp mới này, ngƣời nuôi tôm có thể tự thực hiện xét nghiệm mầm bệnh WSSV ngay tại nơi chọn mua con giống hoặc kiểm tra mầm bệnh WSSV tại ao nuôi khi tôm có các dấu hiệu bất thƣờng. Việc xét nghiệm thực hiện đơn giản và không đòi hỏi trang thiết bị. Mẫu tôm cần xét nghiệm sẽ đƣợc nghiền trong một ống nhỏ có chứa dung dịch cần thiết, sau đó một ít dịch nghiền đƣợc hút và cho vào một đầu que thử rồi chờ vài phút để xem kết quả. Hiện những que thử WSSV dạng này đã có bán ở Việt Nam. Tuy vậy, trong thực tế, một số trƣờng hợp sử dụng que thử này có thể cho kết quả dƣơng tính giả.
34
1.2. NGHIÊN CỨU TẠO VACCINE DỰA TRÊN KHÁNG NGUYÊN VỎ WSSV
1.2.1. Một số biện pháp phòng chống WSSV
1.2.1.1. Đáp ứng miễn dịch chống lại WSSV của tôm
Hệ thống miễn dịch của các động vật không xƣơng sống còn khá sơ khai và ít đƣợc nghiên cứu. Chúng chỉ mới có hệ miễn dịch tự nhiên còn gọi là miễn dịch bẩm sinh [37]. Tuy nhiên, có nhiều cơ chế miễn dịch sử dụng bởi động vật không xƣơng sống có khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh nhƣ: vi khuẩn, nấm và virus. Miễn dịch tự nhiên của tôm đƣợc kích hoạt khi nhận ra tác nhân gây bệnh liên quan đến mô hình phân tử (PAMPs) thông qua các thụ thể đặc hiệu (PRRS). Bƣớc nhận dạng này trực tiếp hoặc gián tiếp gây nên nhiều cơ chế bảo vệ khác nhau ở tôm một cách phức tạp để loại bỏ các tác nhân gây bệnh [88, 89]. Các đáp ứng miễn dịch tế bào bao gồm sự thực bào, hình thành hạch, đóng gói và chết theo chƣơng trình, trong khi phản ứng miễn dịch dịch thể bao gồm hệ thống prophenoloxidase, đông máu, những peptide kháng khuẩn, lectin, Dscam, con đƣờng Toll và IMD [98].
Đáp ứng miễn dịch tế bào của động vật không xƣơng sống đƣợc thực hiện bởi các tế bào máu (hemocyte) có mặt trong máu (hemolymph) của hệ tuần hoàn mở của tôm. Ba loại tế bào máu chính có thể đƣợc xác định trong hầu hết các loài giáp xác là các tế bào hyalin, các tế bào dạng bán hạt và các tế bào dạng hạt. Mỗi tế bào tham gia các sự kiện khác nhau nhƣ sự thực bào, chết theo chƣơng trình, đóng gói và hình thành hạch, sửa chữa vết thƣơng và đông máu. Bên cạnh sự tham gia của nó trong phản ứng của tế bào, các tế bào máu còn cung cấp các peptide kháng khuẩn khác nhau, lectin, chất ức chế proteinase và opsonin hóa nhƣ các peroxinectin protein kết dính tế bào [18].
Tác dụng chống virus của hemocyanin là đáp ứng miễn dịch bẩm sinh quan trọng chống lại WSSV do nó có khả năng làm chậm lại sự lây nhiễm và nhân lên của WSSV. Tuy nhiên, miễn dịch dịch thể của tôm chủ yếu bao gồm hệ thống hoạt hóa prophenoloxidase (proPO) có vai trò điều khiển quá trình melanin hóa tác nhân gây bệnh và các mô bị xâm hại, sự dính kết, sự thực bào, chết theo chƣơng trình cũng nhƣ việc sản sinh các peptide kháng virus, các thành phần gốc tự do oxy hóa
35
trung gian (ROI) và nitrơ hóa trung gian (RNI) [10, 46, 115]. Hình 1.10 là tóm tắt về hệ miễn dịch của tôm [98].
Hình 1.10: Sơ đồ của hệ thống miễn dịch ở tôm [98]
Sự đáp ứng miễn dịch ở tôm đƣợc thực hiện chính bởi các tế bào tạo máu chuyên hóa nhƣ thực bào, quá trình phong tỏa và sự sản sinh các peptide kháng khuẩn hay hoạt hóa phenoloxidase. Tế bào bạch cầu của giáp xác đƣợc chia thành 2 loại: bạch cầu không hạt (hyaline cell) và bạch cầu có hạt (granular cell). Đối với bạch cầu có hạt, trƣớc hết khi bị kích thích bởi β-glucan, quá trình tiêu giảm hạt (degranulation) sẽ xảy ra, từ đó dẫn đến sự phóng thích một số enzyme miễn dịch bao gồm prophenoloxidase (proPO), serine proteinase, peroxinectin (PX), và α2- macroglobulin (α2-M) [19]. Tiếp theo, với sự xúc tác của serine proteinase (SP) giống trypsin đƣợc biết có vai trò kích hoạt hệ thống proPO (proPO-activating (PPA) không hoạt động chuyển thành phenoloxidase (PO) hoạt động. PO là một enzyme chứa ion Cu2+, xúc tác tiếp theo 2 quá trình o-hydroxyl hoá monophenol và oxy hoá diphenol thành quinine. Chức năng quan trọng của PO là chuyển hợp chất tyrosine thành dihydroxyphenylalanine (DOPA) cũng nhƣ là DOPA-quinone, sau
36
đó quinone sẽ đƣợc trùng hợp thành melanine. Trong suốt quá trình melanin hóa, melanin sẽ bao lấy vi khuẩn hay vật lạ và phóng thích ra ngoài lớp vỏ cutin. Cơ chế này cũng giống nhƣ cơ chế miễn dịch của côn trùng, sắc tố melanin sẽ tích tụ trên vỏ giáp của giáp xác, đó cũng là bằng chứng của quá trình bị tổn thƣơng.
Song song với quá trình melanin hóa, các peptide kháng khuẩn bao gồm crustin, các yếu tố kháng lipopolysaccharide, penaeidin, lectin và lysozyme… cũng đƣợc tiết ra bởi bạch cầu có hạt để tiêu diệt mầm bệnh (Hình 1.11). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các β-glucan kích thích quá trình melanin hóa và quá trình thực bào thông qua sự nhận biết bởi các protein đặc biệt là PRPs (specific pattern-recognition proteins): LGBP (lipopolysaccharide và β-1,3-glucan-binding protein) và βGBP (β- glucan-binding protein) trên tế bào bạch cầu (Hình 1.11) [3, 52].
Hình 1.11: Cơ chế kích thích miễn dịch không đặc hiệu của tôm khi bị kích thích bởi β-glucan [3].
37
Ở tế bào bạch cầu có hạt sẽ xảy ra quá trình melanin hóa để bao lấy tác nhân gây bệnh và phóng thích ra ngoài lớp vỏ cutin; còn ở tế bào bạch cầu không hạt sẽ xảy ra quá trình thực bào. Trong quá trình thực bào này sẽ sinh ra các dạng oxy phản ứng bao gồm : gốc superoxide (O2.-), gốc hydroxyl (.OH) và peroxide hydro (H2O2) để tiêu diệt tác nhân gây bệnh, từ đó làm tăng hoạt tính của superoxide dismutase (SOD) nhằm cân bằng chuyển hóa các gốc tự do sang dạng không gây độc cho cơ thể tôm (Hình 1.11) [52]. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy khả năng làm tăng miễn dịch của tôm thông qua việc tăng hoạt độ của superoxide dismutase khi tôm đƣợc kích thích miễn dịch bởi β-glucan và hợp chất polysaccharide chứa lƣu huỳnh [96].
Để đánh giá đáp ứng miễn dịch ở tôm, ngƣời ta đã đánh giá hoạt độ một số enzyme trong hemolymph có liên quan đến đáp ứng miễn dịch bao gồm phenoloxidase (PO), superoxide dismutase (SOD), hay nitric oxide synthase cảm ứng (iNOS) [34, 86].
1.2.1.2. Các kết quả nghiên cứu về phòng chống WSSV
Vì chƣa có một phƣơng pháp nào điều trị hiệu quả bệnh đốm trắng nên về mă ̣t lâu dài thì chỉ có c ác phƣơng pháp phòng bê ̣nh đƣợc phát triển nhằm kiểm soát đƣơ ̣c di ̣ch bê ̣nh cho tƣ̀ng giai đoa ̣n sinh trƣ ởng của tôm. Thƣ̣c tế nuôi tôm cho thấy trong giai đoạn ƣơng trƣ́ng , viê ̣c thau rƣ̉a trƣ́ng và ấu trùng nên kết hợp với