Protein VP28 và nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSV

VP28 là protein có nhiều nhất ở lớp vỏ WSSV, đóng vai trò chủ đạo giúp virus gắn đặc hiệu lên tế bào tôm (bƣớc khởi đầu cho quá trình lây nhiễm của virus). Cấu trúc của VP28 cũng tái khẳng định vai trò của VP28 là một protein gắn bám [124]. VP28 đƣợc mã hóa bởi gen wsv421 có khối lƣợng phân tử 27,5 kDa, lần đầu tiên đƣợc xác định là một protein vỏ với một vùng xuyên màng giả định ở tận cùng đầu N, 5 vị trí N-glycosyl hóa và 2 vị trí O-glycosyl hóa. Tuy nhiên, có một vùng kị nƣớc mạnh ở tận cùng đầu N của VP28, bao gồm cả vùng xuyên màng giả định [124]. Một số bằng chứng cho thấy VP28 liên quan trực tiếp đến tính chất lây

41

truyền của WSSV ở tôm. Chính cấu trúc của VP28 đã gợi ý rằng VP28 có thể đóng vai trò quan trọng là một protein xâm nhập.

Sự tƣơng tác của VP28 với các protein cấu trúc khác của WSSV cũng đã đƣợc nghiên cứu. Bằng việc sử dụng các phân tích miễn dịch đã cho thấy protein lớp vỏ nucleocapsid VP26 và VP24 đều bám vào VP28 [120]. Điều nổi bật ở đây là cả 3 loại protein cấu trúc này đều có mức độ tƣơng đồng cao về trình tự các nucleotide và acid amin, chứng tỏ chúng phát sinh từ chung một nguồn gốc và sau quá trình nhân lên của gen, chúng phân tách ra, tiến hóa theo các hƣớng thực hiện chức năng khác nhau. Cả ba loại protein này đều có một vài vùng bảo thủ chung, bao gồm các vùng kị nƣớc mạnh với chuỗi α-helix đóng vai trò nhƣ vùng gian màng và một vùng khác có khả năng liên quan đến các tƣơng tác trung gian giữa các protein [105]. Nhìn chung, các nghiên cứu đều chỉ ra rằng VP28 là một protein vỏ đa chức năng, không chỉ bám vào protein màng của tế bào chủ (từ đó làm trung gian trong quá trình xâm nhiễm của WSSV) mà còn tƣơng tác với VP24, VP26 để cố định lớp vỏ ngoài vào lớp tegument bên dƣới. Thêm vào đó, VP26 tƣơng tác với nucleocapsid [121].

Gần đây VP26 và VP28 đã đƣợc kết tinh và nghiên cứu sâu về cấu trúc không gian [97]. Cả hai loại protein này đều đƣợc cấu thành bởi các cấu trú c gấp nếp β, chúng thƣờng có đầu N nhô ra ngoài. Các nghiên cứu sâu hơn còn cho thấy các protein này ở lớp vỏ đều có cấu trúc dạng trimer. So sánh cấu trúc của hai loại protein này đã chỉ ra rằng chúng có chung nguồn gốc tiến hóa từ protein cấu trúc của loại virus khác, bao gồm protein lớp vỏ ngoài P3 của bacteriophage PRD1 hay protein vỏ hexon của adenovirus và một số loại protein khác. Dựa trên những đặc điểm cấu trúc này cùng với những bằng chứng từ những nghiên cứu trƣớc, Tang và tập thể [97] đã giả thiết rằng vùng đầu N xuyên màng của VP26 và VP28 đƣợc cố định trên lớp vỏ của virus. Bằng cách này mà cấu trúc lõi gồm các dải β lộ ra phía ngoài lớp vỏ giúp chúng có thể dễ dàng tƣơng tác với các thụ thể hoặc màng của tế bào vật chủ khởi đầu quá trình xâm nhiễm. Các cấu trúc β cũng có thể tạo các liên kết trung gian với một số loại protein cấu trúc khác nhƣ VP26 và VP24 [21, 97].

42

Hình 1.12: Cấu trúc không gian của protein VP28 [97]

a.Monomer của VP28 được đánh dấu hai đầu N và C b.Trimer nhìn ngang

c. Trimer nhìn từ trên xuống

Cấu trúc đầy đủ của VP 28 bao gồm một chuỗi β và một chuỗi xoắn α nhô ra khỏi cấu trúc chuỗi β. Chiều dài phần đầu N của chuỗi xoắn α nhô ra khỏi chuỗi β là khoảng 20 Å (Hình 1.12). Phần nhô ra của chuỗi xoắn α (gồm 15 acid amin , tƣ̀ Thr32 đến Asn 47) đƣợc gắn với lõi chuỗi β bởi 2 gốc acid amin của vòng xoắn . Chiều dài chuỗi β là khoảng 35 Å và có đƣờng kính kho ảng 15 Å. Có tổng số 9 dải β (β1↓ β2↑ β3↓ β4↓ β5↑ β6↓ β7↑ β8↓ β9↑), chủ yếu s ắp xếp theo kiểu đối song song. Bên cạnh đó, tƣơng tƣ̣ nhƣ VP26, mô ̣t chuỗi xoắn α treo ở phía ngoài chuỗi β và khe rỗng của chuỗi β khá ki ̣ nƣớc. Có tất cả 25 gốc kị nƣớc nằm ở mặt trong của khe rỗng, đƣơ ̣c cấu ta ̣o bởi 7 Phe, 8 Ile, 1 Leu, 4 Met và 5 Val [108]. Nghiên cứu của Wang và tập thể [113] cho thấy các vị trí quyết định kháng nguyên của VP28 là từ gốc acid amin 28 đến 67, 87 đến 93 và từ 171 đến 204.

Trong hầu hết các nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSV, VP28 là một trong những đích nghiên cứu chính vì đóng một vai trò quan trọng trong bƣớc đầu lây nhiễm của virus. VP28 tƣơng tác với các protein của tế bào chủ nhƣ PmRab7 [90], Hsc70 [122], bộ chuyển đổi tín hiệu và yếu tố hoạt hóa phiên mã (STAT) để mang lại sự lây nhiễm virus. Do có tính kháng nguyên cao và khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của tôm nên VP28 là protein đƣợc lựa chọn để tạo kháng thể chẩn đoán WSSV cũng nhƣ tạo vaccine giúp tôm phòng bệnh đốm trắng [83, 114]. Trình

43

tự nucleotide của gen mã hóa cho protein VP28 cũng đƣợc chú trọng. Năm 2002, Zhang và tập thể [126] công bố kết quả nhân dòng và biểu hiện thành công gen mã hóa cho protein VP28 bằng vector pBV220 trong DH5α. Năm 2004, Sathish và tập thể [85], khi phân phân tích gen vp28 của của WSSV phân lập đƣợc ở Ấn Độ đã cho thấy trình tự DNA gen vp28 (AY422230) có hai sự khác biệt so với những trình tự gen vp28 đã đƣợc công bố trƣớc đó ở Ấn Độ. Hai sự thay thế nucleotide này đều gây ra sự biến đổi các acid amin. Trong nghiên cứu của Jha và Xu [44] cho thấy gen mã hóa cho protein VP28 đƣợc nhân bản có kích thƣớc khoảng 615 bp. Kết quả giải trình tự gen vp28 đƣợc so sánh với những trình tự gen vp28 đã đƣợc công bố trên GenBank và cho thấy không có bất cứ sự khác biệt nào giữa những trình tự đƣợc so sánh. Tuy nhiên, nghiên cứu của Braunig và tập thể [13] chỉ ra rằng trình tự DNA của gen vp28 phân lập đƣợc ở Brazil tƣơng đồng 98-100% với những trình tự công bố ở Ấn Độ (DQ681069; DQ013881; DQ013882; DQ013883), Hàn Quốc (AY324881), Nhật Bản (AY249443), Indonesia (AY249441) và Trung Quốc (AY249440). Tuy nhiên, trình tự này chỉ tƣơng đồng 90% với trình tự vp28 của Mexico (EU931415). Trong khi đó tại Việt Nam, nghiên cứu 25 mẫu tôm nhiễm WSSV thu nhận ở tỉnh Sóc Trăng cho thấy trình tự gen vp28 của những mẫu này (AY168644) hoàn toàn tƣơng đồng với 10 trình tự vp28 khác của Nhật Bản, Indonesia, Hà Lan, Trung Quốc. Tuy nhiên, có sự sai khác 1 nucleotide ở vị trí 119 so với trình tự vp28 của Trung Quốc (AF502435) và 1 nucleotide ở vị trí 443 với với Hàn Quốc (AF380842) [9].

Protein VP28 tái tổ hợp (rVP28) đã đƣợc nghiên cứu biểu hiện ở nhiều hệ thống khác nhau. Một trong những đối tƣợng chính đƣợc dùng cho biểu hiện là vi khuẩn gram âm. VP28 đã đƣợc biểu hiện thành công ở E. coli. Năm 2004, Sathish và tập thể [85] công bố viê ̣c biểu hiện thành công VP28 ở E. coli BL21 (DE3) sử dụng vector biểu hiện pREST B. Protein tái tổ hợp VP28 đƣợc cảm ứng biểu hiểu bằng IPTG sau đó đƣợc tinh sạch nhờ cột sắc kí ái lực trong điều kiện biến tính sử dụng ure 8M. Witteveldt và tập thể [114] đã biểu hiện thành công VP28 gắn đuôi histidine (Histag) trên vector pET28 trong E. coli và sử dụng dịch chiết protein trộn

44

với thức ăn tôm để thử nghiệm dạng vaccine đƣờng uống này cho tôm sú Penaeus monodon. Kết quả thử nghiệm bƣớc đầu cho thấy VP28 tái tổ hợp có hiệu quả bảo vệ miễn dịch lên tới 70%. Witteveldet và nhóm nghiên cứu [114] cũng đánh giá tiềm năng sử dụng dạng vaccine có rVP28 có đầu tận cùng N dung hợp với protein gắn với maltose đƣợc biểu hiện ở E. coli. Tỉ lệ sống sót của tôm cao hơn đáng kể khi sử dụng rVP28 này (4 g/1g tôm), đạt tới 33% sau hai ngày cảm nhiễm với WSSV, nhƣng hiệu quả bảo vệ mất đi sau 25 ngày. Trong một nghiên cứu tƣơng tự, Namikoshi [72] đã đã chứng minh rằng khi tiêm rVP28 hai lần (100 g/1g tôm/lần) thì khả năng bảo vệ chống WSSV đạt mức cao nhất, tỷ lệ sống sót tƣơng đối (RPS) lên tới 95%.

Jha và Xu [44] đã nhân dòng gen mã hóa cho VP28 thu đƣợc từ tôm nhiễm WSSV tại Trung Quốc bằng vector pUCm-T và pET-30a (+) trong E. coli BL21. Các tác giả đã chứng minh rằng bằng việc sử dụng hệ thống biểu hiện này có thể dễ dàng thu đƣợc một lƣợng lớn protein tinh sạch. Nghiên cứu đã chỉ ra hƣớng sử dụng protein tái tổ hợp nhƣ một vaccine qua đƣờng uống để tăng cƣờng khả năng bảo vệ của tôm đối với virus đốm trắng. Jha và Xu đã đánh giá đƣợc khả năng sử dụng của dạng vaccine theo đƣờng tiêm của rVP28 đƣợc biểu hiện trong nấm men Pichia pastoris. Tôm càng P. clarkia đƣợc tiêm rVP28 (2 g/1g tôm càng) có khả năng bảo vệ chống WSSV cao hơn, đạt 91% ở ngày thứ 3 sau khi tiêm và giảm xuống 78% ở ngày thứ 21. Trong một nghiên cứu khác [16] cũng biểu hiện và tinh sạch VP28 tái tổ hợp từ chủng Brevibacillus brevis và trộn các chủng tái tổ hợp này vào thức ăn cho tôm để đánh giá hiệu quả của vaccine theo đƣờng uống này. Kết quả cho thấy hiệu quả bảo vệ tăng từ 30-70% phụ thuộc vào lƣợng VP28 đã cho ăn và thời gian sau khi thử thách với WSSV. Bên cạnh đó, tôm đƣợc ăn thức ăn có trộn rVP28 25 µg/1g tôm trong vòng 7 ngày trƣớc khi nhiễm WSSV có khả năng sống sót lên tới 92,8% ở ngày thứ 3 sau khi nhiễm virus.

Hou và tập thể [38] cũng đã nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa vp28 ở E. coli BL21sử dụng vector pET30a . Protein VP28 tái tổ hợp đƣợc tinh sạch và dùng gây miễn dịch ở chuột để tạo kháng thể đơn dòng. Sự có mặt của VP28 đƣợc quan

45

sát dƣới kính hiển vi miễn dịch điện tử. Kháng thể đơn dòng đặc hiệu với rVP28 có khả năng nhận biết các VP28 của WSSV. Đồng thời, các tác giả cũng sử dụng kháng thể này trong phân tích dot-blot để phát hiện sự xâm nhiễm tự nhiên của WSSV. PCR cạnh tranh cho thấy nồng độ virus khoảng 104 copy/mg mô tế bào.

Syed-Musthaq và Kwang [91, 92] đã biểu hiện thành công VP28 trên bề mặt

baculovirus dƣới sự kiểm soát của promoter ie1 (Bac-VP28). Bac-VP28 biểu hiện đƣợc một lƣợng lớn VP28 (65,3 µg/ml). Chủng tái tổ hợp này đƣợc dùng nhƣ một dạng vaccine đƣờng uống cho tôm chống WSSV. Tôm đƣợc cho ăn với 2 dạng vi khuẩn: chủng tái tổ hợp (Bac-VP28) hoặc chủng hoang dại (Bac-wt). Sau đó WSSV đƣợc lây nhiễm vào tôm ở ngày thứ 3 và ngày thứ 15 sau khi xử lý vaccine. Kết quả là tôm đƣợc xử lý với Bac-VP28 có tỉ lệ sống sót cao hơn đáng kể so với nhóm sử dụng Bac-wt hay nhóm tôm không đƣợc xử lý. Tuy nhiên, tính đến nay, mô hình này mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm, chƣa có bất cứ thử nghiệm thực tế nào với quy mô công nghiệp.

Mu và tập thể [70] đã tạo ra vector plevp28 có chứa promoter ie1 và vùng mã hóa cho VP28 để biểu hiện gen vp28 trong E. coli. Protein VP28 tái tổ hợp đƣợc sử dụng qua đƣờng uống cho tôm. Kết quả thử nghiệm cho thấy rằng tôm đƣợc cho uống dịch chứa E. coli mang plevp28 có khả năng kháng virus đốm trắng cao hơn.

Ở Việt Nam , nhóm nghiên cứu của Phan Thị Phƣợng Trang và tập thể [9] đã biểu hiện thành công protein VP28 tái tổ hợp ở E. coli dƣới dạng Histag-VP28 và VP28-GST sử dụng hai vector biểu hiện là pQE39 và pGEX-2TK tƣơng ứng. Các tác giả cũng đã tinh sạch đƣợc 1,82 mg rVP28 từ 1 lít dịch nuôi cấy sử dụng cột Ni- NTA agarose. Nghiên cứu này tạoprotein VP28 để sản xuất kháng thể đơn dòng phục vụ việc chẩn đoán sự có mặt của WSSV. Cũng theo hƣớng nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên VP28 để ứng dụng trong chẩn đoán phát hiện WSSV ở tôm. Đỗ Thị Thảo và tập thể [7] đã bƣớc đầu thành công trong việc tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng VP28 và ứng dụng kháng thể làm que thử nhanh phát hiện WSSV ở tôm sú.

Nhìn chung, vaccine đƣờng uống dựa trên cấu trúc VP28 đƣợc xem là một biện pháp khả thi do tiêm từng cá thể tôm đơn lẻ khó áp dụng ngoài thực tế với quy mô lớn. Tóm lại, sử dụng rVP28 là một biện pháp hiệu quả giúp tăng khả năng sống sót

46

của tôm đối với WSSV. Các phƣơng pháp này có đặc điểm chung là khó áp dụng trên thực tế do protein VP28 sẽ bị biến tính hoặc bị phân hủy nếu nhƣ đƣợc cho trực tiếp vào các đầm nuôi tôm và chi phí để sản xuất VP28 cũng rất cao. Do đó, gần đây nhiều nhóm nghiên cứu đã tập trung vào việc phát triển các dạng vaccine vi khuẩn sống tái tổ hợp biểu hiện VP28. Mặc dù đã có khá nhiều nghiên cứu về việc tạo vaccine tái tổ hợp phòng ngừa WSSV dựa trên protein vỏ của WSSV trong đó nổi bật là VP28 và V26, tuy vậy các kết quả nghiên cứu mới chỉ là bƣớc đầu, chƣa có một loại vaccine chính thức nào đƣợc tạo ra. Vì vậy việc tiếp tục nghiên cứu để tạo đƣợc vaccine phòng bệnh đốm trắng là hết sức cần thiết.

1.2.3. Các protein bề mặt khác và nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSV

Trong những năm gần đây, một số nhà nghiên cứu độc lập đã tìm ra các chiến lƣợc chống WSSV để bảo vệ tôm, bao gồm vaccine bị bất hoạt [14, 72], vaccine protein tái tổ hợp [34, 44, 99, 114, 129], vaccine DNA [51, 69, 72, 77] và vaccine sợi đôi RNA [31, 43, 50, 69, 81, 84] (Bảng 1.4).

Bảng 1.4: Các chiến lƣợc vaccine chống WSSV để bảo vệ tôm Chiến lƣợc Vaccine Thành phần của vaccine

1. Bất hoạt WSSV bất hoạt

2. Protein tái tổ hợp

VP19, VP24, VP28 biểu hiện ở vi khuẩn VP28 biểu hiện ở Bombyx mori

VP28 biểu hiện ở Bacillussubtilis

VP28 biểu hiện ở Baculovirus

3. DNA

Cấu trúc DNA VP15, VP28, VP35 và VP281 Cấu trúc DNA VP28 với hạt nano chitosan Cấu trúc DNA VP28 Salmonella typhimurium

Cấu trúc DNA VP28

4. RNA sợi đôi

Sợi đôi RNA không đặc hiệu

Sợi đôi RNA đặc hiệu cho VP28, VP281 Sợi đôi RNA đặc hiệu cho VP28

Sợi đôi RNA đặc hiệu cho VP28, VP26

Mặc dù có nhiều phƣơng pháp chống lại WSSV đã đƣợc áp dụng, nhƣng các protein vỏ vẫn là đích cơ bản cho sự phát triển vaccine chống lại WSSV. Bởi vì protein cấu trúc vỏ đóng vai trò quan trọng trong quá trình lây nhiễm của virus và

47

thƣờng liên quan đến sự xâm nhập, lắp ráp và nảy chồi của virus. Đặc biệt, VP28 là một protein vỏ chính của WSSV tham gia vào hệ thống lây nhiễm ở tôm [93, 106]. Trong suốt quá trình lây nhiễm, protein VP28 hoạt động nhƣ những protein gắn bám của virus vào tế bào tôm [124] và tƣơng tác với các protein tế bào chủ nhƣ PmRab7 [90], đầu dò tín hiệu và các nhân tố hoạt hóa phiên mã [62].

Đã có một số nghiên cứu sử dụng protein vỏ tái tổ hợp của WSSV để kích thích kháng virus ở tôm P. japonicus và tiêm vaccine với rVP28, một lần duy nhất cho thấy khả năng kháng VSSV tăng lên đáng kể, khi sinh vật tiêm vaccine 2 lần với rVP28, mỗi lần tiêm cách nhau 20 ngày, cho thấy sự giảm tỉ lệ chết xuống 4% [72]. Đáp ứng bảo vệ bắt đầu có tác dụng sau 10 ngày tiêm phòng, nhƣng không có tác dụng tại 30 ngày tiêm phòng, chƣ́ng tỏ rằng cơ chế liên quan đến đáp ứng này có thể khác so với những trƣờng hợp đã quan sát đƣợc khi sinh vật sống sót sau khi nhiễm WSSV. Tƣơng tự, tỉ lệ chết thấp đã quan sát đƣợc ở P. monodon bằng liều uống hoặc tiêm dƣới cơ với rVP28, rVP19 [114], và rVP292 [109]. Kết quả của Kono và tập thể [49] chỉ ra rằng, poly I: C hoặc imiquimod kết hợp rVP28 làm tăng tỷ lệ bảo hộ và tạo ra phản ứng miễn dịch ở tôm Marsupenaeus japonicus chống lại WSSV. Tôm đƣợc tiêm rVP28 + poly I: C và rVP28 + imiquimod có lệ sống cao hơn đáng kể tƣơng ứng là 52 và 58%, so với rVP28. Vì vậy, poly I: C và imiquimod có tiềm năng đƣợc sử dụng nhƣ chất phụ gia trong tiêm chủng cho tôm.

Hệ miễn dịch của tôm tuy còn khá đơn giản, nhƣng qua một số nghiên cứu gần đây cho thấy tôm có khả năng phòng ngừa đặc hiệu WSSV khi đƣợc kích thích bởi