BÀO TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TẠO VACCINE
1.3.1. Bào tử B. subtilis và đặc tính hình thành bào tử
B. subtilis là một vi khuẩn gram dƣơng, sống hiếu khí, thƣờng đƣợc tìm thấy trong đất. Vi khuẩn đơn lẻ có hình que khi quan sát dƣới kính hiển vi nên còn đƣợc gọi là trực khuẩn [27]. B. subtilis đƣợc sử dụng rộng rãi dƣới dạng probiotic để kích thích tiêu hóa vì có nhiều enzyme hữu ích, không độc hại và có khả năng tạo hệ vi khuẩn có ích trong đƣờng ruột [36].
B. subtilis có khả năng sống sót cao trong một thời gian dài khi gặp các yếu tố môi trƣờng bất lợi nhƣ nhiệt độ hay độ acid cao, nghèo chất dinh dƣỡng nhờ khả năng đặc biệt là sinh nội bào tử (endospore). Nội bào tử là một dạng sống đặc biệt của vi khuẩn, đƣợc hình thành khi môi trƣờng sống trở nên khắc nghiệt nhƣ thiếu dinh dƣỡng, nhiệt độ cao… Vì mỗi tế bào chỉ sinh ra mô ̣t bào tử nên đây không phải là loại bào tử có chức năng sinh sản nhƣ ở nấm. Về hình dạng, bào tử B. subtilis trƣởng thành có hình cầu hoặc elip (Hình 1.13), đƣờng kính khoảng 0,8-1,2 µm [27].
Hình 1.13: Hình dạng ngoài của nội bào tử B. subtilis [27]
Về cấu tạo, ngoài cùng của bào tử là lớp vỏ ngoài (exosporium) mỏng và có thể có các phần sót lại của tế bào mẹ. Tiếp đó là lớp áo bào tử (spore coat) dày khoảng 3 nm, chứa 3-15 lớp protein (chiếm 50-80% protein tổng số của bào tử),
49
không thấm đối với nhiều phân tử chất độc, tạo nên tính kháng hóa chất của nội bào tử. Áo bào tử chứa một số enzyme tham gia vào sự nảy mầm của bào tử. Nằm dƣới áo bào tử là lớp vỏ trong (cortex), chiếm 36-60% thể tích của nội bào tử, đƣợc cấu tạo từ peptidoglican nhƣng chứa ít liên kết chéo hơn so với tế bào dinh dƣỡng. Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ này lên tới 20 atm, lƣợng nƣớc là 70% (lƣợng nƣớc của tế bào sinh dƣỡng là 80%), cao hơn nhiều so với lƣợng nƣớc trung bình trong bào tử (khoảng 40%). Cuối cùng là thành bào tử (spore wall) bao quanh thể sinh chất hay lõi (core). Lõi chứa các cấu trúc thông thƣờng của tế bào nhƣ các ribosome và một thể nhân, nhƣng không hoạt động về mặt trao đổi chất (Hình 1.14).
Cho đến nay ngƣời ta còn chƣa biết chính xác tại sao nội bào tử có tính kháng nhiệt và kháng các tác nhân gây chết khác cao đến nhƣ vậy. 15% chất khô của nội bào tử là acid dipicolinic đƣợc kết hợp với các ion canxi. Vai trò chính xác của acid dipicolinic còn chƣa đƣợc biết rõ, song canxi trợ giúp tính đề kháng với nhiệt độ, độ ẩm, các tác nhân oxy hóa và đôi khi có thể dipicolinate canxi làm bền các acid nucleic của bào tử. Gần đây ngƣời ta tìm thấy trong nội bào tử một loại protein hòa tan trong acid có khối lƣợng phân tử thấp liên kết với DNA và có vai trò bảo vệ DNA chống lại sức nóng, bức xạ, khô hạn và hóa chất.
50
IC (Inner coat): lớp áo trong. OC (outer coat): lớp áo ngoài. Cx (cortex): lớp vỏ. gap: khoảng trống giữa lớp áo trong với lớp vỏ. Cl: khối bắt màu tối chưa rõ thành
phần cấu tạo.
Hàm lƣợng nƣớc thấp (10-30% so với tế bào sinh dƣỡng) của thể sinh chất (lõi) giữ vai trò quan trọng trong tính đề kháng với nhiệt, trong khi nhiệt độ phá hủy tế bào bằng cách làm bất hoạt DNA, protein và quá trình này đòi hỏi một lƣợng nƣớc nhất định trong thể sinh chất. Áo bào tử hình nhƣ cũng bảo vệ chống lại các enzyme và hóa chất nhƣ H2O2. Cuối cùng, bào tử chứa một số enzyme sửa chữa DNA. DNA đƣợc sửa chữa trong quá trình nảy mầm và tăng trƣởng sau khi lõi đã đƣợc hoạt hóa trở lại. Sự hình thành bào tử thƣờng xảy ra khi trong môi trƣờng thiếu chất dinh dƣỡng, đặc biệt là thiếu nguồn cacbon hay nitơ hay có sự tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại.
Sự nảy mầm bào tử xảy ra khi có mặt nƣớc và một sự kích thích do hóa chất hoặc do môi trƣờng (nhân tố nảy mầm). Khi đã đƣợc khởi động, quá trình nảy mầm hoàn thành trong khoảng 90 phút. Nhân tố nảy mầm thay đổi tùy loài, song thƣờng là một phân tử chất hữu cơ nhỏ nhƣ acid amin, hoặc một muối vô cơ. Nhân tố này sẽ kích thích sự tạo thành các enzyme thủy phân bởi màng bào tử. Các enzyme có vai trò phân giải các lớp áo và để cho lõi có cơ hội tiếp xúc với nƣớc. Khi lõi đã hấp thụ đƣợc nƣớc và các chất dinh dƣỡng, nó sẽ bắt đầu tăng trƣởng ra phía ngoài vỏ.
1.3.2. Một số protein bề mặt của B. subtilis
Trong các thành phần cấu tạo của bào tử, đối tƣợng đƣợc quan tâm hơn cả là lớp áo. Chính nhờ lớp áo này mà bào tử có khả năng chống lại các dung môi hữu cơ hay lysozyme có ở môi trƣờng ngoài. Gần đây, những tài liệu về bào tử đã cho thấy rằng lớp áo bào tử thực ra rất linh động, có thể co lại hoặc phồng to [28]. Chính nhờ đặc điểm này mà tế bào có thể loại bớt nƣớc trong quá trình hình thành bào tử và hút nƣớc vào để nảy mầm. Ở B. subtilis ngƣời ta đã tìm thấy ít nhất hơn 20 loại polypeptide có mặt ở lớp áo (trong và ngoài) của bào tử, bảng 1.5 liệt kê một số loại protein này [27].
51
Bảng 1.5: Một số protein trong lớp áo bào tử vi khuẩn B. subtilis Loại peptide KLPT (kDa) Vị trí trong bào tử Vai trò
cotA 65 Lớp áo ngoài Chƣa biết rõ cotB 59 Lớp áo ngoài Chƣa biết rõ cotC 12 Lớp áo ngoài Chƣa biết rõ cotD 11 Lớp áo ngoài Chƣa biết rõ
cotE 24 Lớp áo ngoài Cần cho quá trình hình thành lớp áo ngoài cotG 24 Lớp áo ngoài Điều khiển quá trình lắp ráp của cotB cotH 42,8 Lớp áo trong Điều khiển quá trình lắp ráp của các
protein ở lớp áo ngoài
Lớp áo ngoài là nơi tập trung của 4 loại protein chính là cotA (65 kDa), cotB (59 kDa), cotG (37 kDa), cotC (12 kDa). Trong đó cotB, cotG và cotC đều chứa những trình tự lặp lại 12-13 acid amin giàu lysine và tyrosine [74]. Cho đến nay, vai trò và vị trí chính xác của nhiều loại protein bề mặt vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu một cách đầy đủ. Những nghiên cứu ban đầu để biểu hiện một protein ngoại lên bề mặt bào tử mới chỉ tập trung chủ yếu vào hai loại protein của lớp áo là cotB và cotC. Trên thực tế, hai yếu tố này của lớp áo dƣờng nhƣ không đóng vai trò cần thiết cho quá trình sinh nội bào tử cũng nhƣ sự nảy mầm. Điều đó càng khẳng định ƣu thế và tiềm năng sử dụng cotB hay cotC trong hệ thống biểu hiện bề mặt.
Nhƣ đã đề cập ở trên, cotB là một protein nằm ở lớp áo ngoài của bào tử. Gen mã hoá cho cotB chịu sự điều khiển bởi hai yếu tố là σκ và GerE, một loại protein gắn với DNA. CotB có đầu C ƣa nƣớc mạnh đƣợc tạo bởi trình tự lặp lại gồm 27 acid amin giàu serine, glutamine và lysine trong đó serine chiếm tới hơn 50% ở vùng đầu C. Quá trình sao chép gen cotB chỉ diễn ra trong tế bào mẹ mà không xảy ra ở trong tế bào đã tạo bào tử. Khi đã đƣợc tổng hợp trong tế bào chất của tế bào mẹ, cotB đƣợc lắp ráp xung quanh vùng tạo bào tử. Ngƣời ta cũng đã tìm đƣợc những bằng chứng cho thấy mối quan hệ phụ thuộc giữa cotB với các yếu tố cotE, cotG và cotH trong quá trình lắp ráp và hình thành dạng cấu trúc cuối cùng
52
của cotB [28]. Cũng giống nhƣ cotC, cotB và protein ngoại lai đƣợc dung hợp với nó sẽ không phải trải qua bƣớc chuyển qua màng tế bào nhƣ những hệ thống biểu hiện ở các vi khuẩn khác [27].
1.3.3. Biểu hiện protein ngoại lai trên bề mặt bào tử
Bào tử B. subtilis là một đối tƣợng tốt đƣợc sử dụng trong các hệ thống biểu hiện protein ngoại lai lên bề mặt cho các mục đích khác nhau, vì chúng có ƣu điểm nổi trội nhƣ độ an toàn cao, độ bền cao có khả năng chống chịu tốt trong các điều kiện khắc nghiệt, có thể bảo quản trong một thời gian dài và tƣơng đối dễ thao tác.
Cấu trúc và chức năng của CotB và CotC càng khẳng định ƣu thế và tiềm năng sử dụng CotB hay CotC trong hệ thống biểu hiện bề mặt. Sơ đồ cấu trúc của protein đích khi gắn với protein vỏ của bào tử B. subtilis (cotB chẳng hạn) đƣợc miêu tả nhƣ ở hình 1.15.
Hình 1.15: Mô hình biểu hiện protein ngoa ̣i trên bề mặt bào tử B. subtilis sử
dụng protein của lớp áo bào tử. Protein dung hợp gồm phần màu xanh dƣơng là protein chuyên chở và phần màu hồng là một protein ngoại lai [74]
Dựa trên nguyên tắc thiết kế protein dung hợp nhƣ trên, nhiều nhà nghiên cứu đã biểu hiện nhiều loại kháng nguyên của vi khuẩn lên bề mặt bào tử với tiềm năng tạo
53
ra vaccine tái tổ hợp bền, dễ bảo quản và tiện dụng. Một trong những kháng nguyên đƣợc biểu hiện thành công trên bề mặt bào tử B. subtilis đó là đoạn peptide 459 acid amin đầu C của độc tố uốn ván (C- terminal fragment of the tetanus toxin, viết tắt là TTFC) với CotB là thành phần dung hợp [28].
Bên cạnh đó, đã có nhiều công trình nghiên cứu biểu hiện protein VP28 trên bề mặt bào tử B. subtilis thông qua hai yếu tố dung hợp CotB và CotC đem lại hiệu quả bảo vệ giúp tôm chống lại WSSV. Fu và tập thể [34] đã tạo ra một chủng vi khuẩn
B. subtilis tái tổ hợp biểu hiện mạnh VP28 có khả năng bảo vệ miễn dịch tới 83% chống lại WSSV ở một loài tôm Trung Quốc (Fenneropenaeus chinensis) khi cảm nhiễm ở ngày thứ 14. Tuy vậy, khả năng bảo vệ miễn dịch chống lại WSSV vẫn bị giảm dần khi nhiễm virus từ tuần thứ 2 sau khi ngừng cho tôm ăn vi khuẩn tái tổ hợp chứa VP28. Gần đây nhất, Ning và tập thể [74] đã biểu hiện protein VP28 trên bề mặt của bào tử B. subtilis bằng cách sử dụng CotB hoặc CotC là một yếu tố dung hợp. Bào tử B. subtilis có biểu hiện VP28 trên bề mặt đã đƣợc bổ sung vào thức ăn của tôm và cho tôm càng xanh ăn bằng đƣờng miệng trong vòng 7 ngày. Tôm sau 7 ngày đã đƣợc trực tiếp thử thách với WSSV. Kết quả thu đƣợc là tôm sử dụng bào tử CotB-VP28 đã đƣợc bảo vệ 37,9% còn khi sử dụng bào tử CotC-VP28 bảo vệ 44,8% trong khi tỷ lệ đƣợc bảo vệ của tôm chỉ sử dụng bào tử B. subtilis không biểu hiện VP28 chỉ là 10,3%. Khi tiến hành cho tôm sử dụng thức ăn có bào tử biểu hiện VP28 trong 7 và 21 ngày thì tỷ lệ bảo vệ đạt đƣợc tƣơng ứng là 46,4% và 50%. Những kết quả ban đầu đã cho thấy bào tử B. subtilis biểu hiện VP28 có khả năng kích thích khả năng chống lại bệnh đốm trắng ở tôm càng xanh [74]. Những nghiên cứu này đã gợi ra hƣớng đi mới trong sản xuất vaccine thế hệ mới có thể dùng qua đƣờng uống, phòng chống một số bệnh nguy hiểm hiện nay nhƣ bệnh đốm trắng ở tôm... Nhờ thuộc tính bền và có thể bảo quản trong một thời gian dài của bào tử, cùng với thao tác đơn giản, dễ dàng, đem lại hiệu quả kinh tế cao mà bào tử B. subtilis đang rất đƣợc quan tâm nhƣ một chất mang trong phát triển vaccine thế hệ mới.
54
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Mẫu tôm thử nghiệm
Các mẫu tôm thẻ chân trắng và tôm sú có biểu hiện nhiễm virus đốm trắng đƣợc thu nhận từ các đầm nuôi tôm tại các địa phƣơng: Hải Phòng; Huế; Khánh Hòa; Thành phố Hồ Chí Minh; Sóc Trăng; Ninh Thuận; Bến Tre; Bình Định, Kiên Giang; Trà Vinh. Các mẫu tôm này đƣợc bảo quản ở -80oC hoặc trong cồn 95oC.
Tôm thẻ chân trắng dùng trong thử nghiệm thử thách khả năng bảo hộ phòng ngừa virus đốm trắng đƣợc sản xuất và ƣơng nuôi khoảng 55-60 ngày tuổi tại Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I là những cá thể khỏe mạnh, có kích thƣớc đồng đều, có khối lƣợng trung bình là 2-5 gam/con, đƣợc kiểm tra âm tính với ký sinh trùng, vi khuẩn gây bệnh và một số virus gây bệnh thƣờng gặp trên tôm trong đó có WSSV.
2.1.2. Các hoá chất và nguyên vật liệu
Chủng vi khuẩn B. subtilis PY79, vector pDG364, pDG364-cotB; pDG364- cotB-gst và kháng thể đặc hiệu kháng VP28 là quà tặng của GS. Simon Cutting, Đại học Hoàng gia Holloway London, Vƣơng quốc Anh. Các chủng vi khuẩn E. coli
DH5α; E. coli BL21 RIL đƣợc mua từ hãng Novagen (Mỹ).
Vector pET28b của hãng Novagen (Mỹ); các oligonucleotide của hãng Life Technology (Mỹ), kit nhân dòng trực tiếp sản phẩm PCR pGEM TA easy vàT4 DNA ligase đƣợc mua từ hãng Promega (Đức); thang chuẩn protein nhuộm màu, thang chuẩn DNA 1kb và 100 bp, hỗn hợp dNTP, đƣợc mua từ hãng Fermentas (Mỹ); Hot-Taq DNA polymerase đƣợc mua từ hãng Enzynomics (Hàn Quốc ); kit thôi gel đƣợc mua từ Bioneer (Hàn Quốc); MagPure viral DNA/RNA nano kit để tinh sạch DNA của virus đƣợc mua từ ANABIO R&D (Việt Nam); Qiaprep- miniprep kit đƣợc mua của hãng Qiagen (Đức); lysozyme đƣợc mua từ hãng Biobasic.(Öc)
55
Các cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu cho các đoạn gen mã hóa cho VP28 của virus gây bệnh đốm trắng WSSV, cho gen cotB; cặp mồi đặc hiệu cho vị trí amyE front, amyE back của vector pDG 364, cặp mồi của vector pGEM T và cặp mồi T7 promoter Fw/T7 terminator Rv đƣợc đặt mua từ hãng Life Technology (Mỹ) (Bảng 2.1).
Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi sƣ̉ du ̣ng trong nghiên cƣ́u nhân bản và biểu hiê ̣n gen vp28
Mồi Trình tự Mục đích thí
nghiê ̣m
vp28.1 Fw 5’- atggatctttctttcactctttcggt-3’ Nhân bản gen VP28 để giải trình tự vp28.1 Rv 5’- aatgagctcggtctcagtgccagagt-3’ vp28.2 Fw 5’-CGCGGATCCGGATCTTTCTTTCACTCTTTCGG-3’ BamHI Nhân dòng gen VP28 vào vector pET28b vp28.2 Rv 5’- CCCAAGCTTTTACTCGGTCTCAGTGCCAGAG-3’ HindIII vp28.3 Fw 5’-CCCAAGCTTGATCTTTCTTTCACTCTTTCGG-3; HindIII Nhân dòng gen VP28 vào vector pDG364
vp28.3 Rv 5’- AAAGAATTCTTACTCGGTCTCAGTGCCAGAG-3’
EcoRI
cotB Fw 5'-CGCGGATCCACGGATTAGGCCGTTTGTCCT-3'
BamHI
Kiểm tra sự có mặt của gen cotB
cotB Rv 5’- CCCAAGCTTGGATGATTGATCATCT -3’
HindIII
pGEM Fw 5’- gctgcaaggcgattaagttg-3’ Kiểm tra nhân
dòng vào vector pGEMT
pGEM Rv 5’- gttgtgtggaattgtcacg-3’
T7 promoter Fw 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ Kiểm tra nhân dòng vào vector pET28b
T7 terminator Rv 5’-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3’
364 Fw 5’- GGAAACACACAAATTAAAACTGGTCTGAT-3’ Kiểm tra nhân dòng vào vector pDG364
56
Các hóa chất còn lại khác đều đƣợc mua từ các hãng có uy tín và đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử.
2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ
Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: tủ ấm nuôi vi khuẩn, máy lắc ổn nhiệt (Satorius, Đức) Quang phổ kế tƣ̉ ngoa ̣i -khả kiến , hệ thống giải trình tự CEQ 8000 (Beckman coulter, Mỹ), Huỳnh quang kế (Spectrofluometer) FL3 – 22 (Jobin Yvon, Mỹ), , máy PCR gradient Mastercycler EP gradient S (Eppendorf, Đức), máy ly tâm Sigma 30K, máy ly tâm lạnh 5417 R (Eppendorf, Đức), thiết bị điện di ngang, điện di đứng, thẩm tách miễn dịch (Biorad, Mỹ) và hệ thống chụp ảnh điện di Geldox (Biorad, Mỹ).
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Thu nhận virus gây bệnh đốm trắng từ mẫu tôm nhiễm bệnh
Phần mô nhiễm bệnh (thƣờng là đầu và phần chân bơi) của tôm nhiễm bệnh đƣợc nghiền đồng nhất trong đệm NTE có chứa Tris-HCl 50 mM, pH 8,5 có chứa NaCl 400 mM, EDTA 5 mM, PMSF 1 mM. Sau đó, dịch nghiền đƣợc ly tâm trong 30 phút ở 10.000 vòng/phút, 4o
C để thu dịch nổi và dịch này đƣợc sử dụng để tách lọc virus. Mỗi ống falcon chứa 50 ml dung dịch có chứa virus gây bệnh đốm trắng, đƣợc pha loãng 10 lần bằng dung dịch PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM). Dịch sau khi pha loãng bằng PBS đƣợc lọc qua màng lọc 0,42 µm và màng lọc 0,2 µm. Phần dịch trong đƣợc giữ lại và bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.3.2 Nuôi cấy tạo bào tử B. subtilis
Các khuẩn lạc tế bào B. subtilis (ở dạng chủng chuẩn PY79, hay ở dạng chủng tái tổ hợp CotB-VP28, CotB-GST-VP28)đƣợc lựa chọn nuôi trong 5 ml môi