3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.6ðông lạnh và giải ñông phôi bò
Những phôi ñủ tiêu chuẩn bao gồm phôi dâu, phôi nang loại A và B ñược ñông lạnh theo phương pháp thuỷ tinh hoá (Vitrification).
Chuẩn bị môi trường ñông lạnh
Môi trường Glycerol EG Xylose PEG (w/v) Sucrose
V1 10% - 10% 1% 0,1M
V2 10% 10% 20% 2% 0,2M
V3 10% 30% 30% 3% 0,3M
Trong ñó: EG: Ethylen glycol PEG: Poly Ethylen glycol V1: môi trường thuỷ tinh hoá 1 V2: môi trường thuỷ tinh hoá 2 V3: môi trường thuỷ tinh hoá 3
ðầu tiên, rửa phôi ít nhất 3 lần trong môi trường DPBS. Sau ñó chuyển phôi vào môi trường V1 và giữ trong 5 phút. Chuyển phôi từ môi trường V1 sang V2 và giữ trong 2 phút. Chuyển phôi từ môi trường V2 sang môi trường V3 và hút ngay vào cọng rạ.
ðông lạnh.
ðưa ñầu cọng rạ có phôi vào nitơ lỏng trong 6-7 giây, sau ñó từ từ nhấn chìm toàn bộ cọng rạ vào nitơ lỏng rồi chuyển vào bình nitơ ñể bảo quản.
Giải ñông phôi.
Với phương pháp ñông lạnh thuỷ tinh hoá quy trình giải ñông ñược tiến hành như sau:
- Chuẩn bị môi trường giải ñông Môi trường 1: Sucrose 0,5M Môi trường 2: Sucroses 0,25M Môi trường 3: DPBS + 20% CS
- Tiến hành: ñưa cọng rạ ra khỏi nitơ lỏng và giữ trong không khí 6 giây sau ñó ñưa vào nước ấm 33oC trong vòng 30 giây ñể giải ñông. Lấy cọng rạ ra khỏi nước ấm và cắt ñầu cọng rạ, chuyển phôi vào môi trường 1 giữ trong 5 phút. Tiếp theo chuyển phôi vào môi trường 2 trong 5 phút và sau ñó chuyển phôi sang môi trường 3, rửa phôi 3-4 lần rồi chuyển vào môi trường nuôi cấy ñể theo dõi.