Thí nghiệm này phục vụ cho việc xác định hàm mục tiêu cho thí nghiệm tìm hàm lượng các chất dinh dưỡng bổ sung và điều kiện LBR tối ưu của nấm men Rhodotorula
nên việc nghiên cứu về kỹ thuật xử lý mẫu được khảo sát trước khi tiến hành thực nghiệm tối ưu thành phần dinh dưỡng bổ sung và điều kiện nuôi cấy.
2.2.1.1 Khảo sát dung môi trích ly và bước sóng hấp thu cực đại
Các hệ dung môi (DM) khảo sát có thành phần theo tỷ lệ thể tích như sau: - DM1 gồm acetonitril: 2-propanol: methanol = 85: 10: 5 [149];
- DM2 gồm acetonitrile: methanol: 2-propanol = 75: 17,5: 7,5 [142]; - DM3 gồm acetonitrile: 2-propanol: ethyl acetate = 40: 40: 20 [29]; - DM4 gồm acetonitrile: methanol: chloroform = 45: 45: 10 [34]; - DM5 gồm acetone: light petroleum = 75: 25 [73].
Khảo sát bước sóng cực đại của mỗi DM với chất chuẩn beta-carotene có nồng độ beta- carotene lần lượt là 10 ppm và 20 ppm. Dò bước sóng và ghi nhận giá trị bước sóng
max (nm) tại đó dung dịch beta-carotene chuẩn có giá trị OD là cực đại.
2.2.1.2 Xác định hàm lượng beta-carotene bằng phương pháp UV-Vis
Xây dựng đường chuẩn với hệ DM3 tại bước sóng max = 454 nm. Từ mật độ quang OD của dung dịch màu thu được, dựa vào phương trình đường chuẩn để xác định hàm lượng beta-carotene (ppm theo CK) có trong mẫu khảo sát.
2.2.1.3 Khảo sát phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men
Dùng hệ DM3 chọn được ở thí nghiệm trên để khảo sát phương pháp phá vỡ tế bào theo các phương pháp sau:
Phương pháp vật lý gồm: nghiền, siêu âm và nhiệt độ (nhiệt độ cao, lạnh đông, cấp đông, rã đông).
- Nghiền: Mẫu được nghiền với bột thủy tinh, tỷ lệ mẫu: bột thủy tinh là 1: 2 (theo Klg).
- Siêu âm: Quá trình đánh sóng siêu âm được thực hiện trên máy Vibra Cell VCX 500 với các thông số kỹ thuật vận hành máy như sau: thời gian 15 phút, nhiệt độ 4oC, thời gian tự động là 5 phút hoạt động và 10 giây nghỉ (pulse 5, pulse off 10s) và mức biên độ năng lượng (amplitude) là 50%.
- Lạnh đông: Thực hiện ở ngăn đá tủ lạnh có nhiệt độ từ -5 đến -1oC, thời gian lưu của mẫu trong tủ lạnh đông là 24 giờ.
- Cấp đông: Thực hiện trong máy cấp đông Ultra Low ở nhiệt độ -70oC, thời gian lưu của mẫu trong máy cấp đông là 12 giờ.
- Lạnh đông và rã đông: Mẫu sau khi đã lạnh đông được đánh tơi và rã đông nhiệt ở 55 ± 1oC trong bể điều nhiệt, thời gian lưu của mẫu trong bể từ 6 đến 8 phút.
- Ủ: Mẫu được ủ trong bể điều nhiệt có nhiệt độ 55 ± 1oC trong thời gian 1 giờ.
Phương pháp hóa học
Dùng dimethyl sulfoxit (DMSO) với tỉ lệ 1% (ml/g). Xử lý mẫu ở nhiệt độ thấp bằng cách đưa mẫu vào tủ mát có nhiệt độ 15 ± 1oC trong thời gian 1 giờ.
Phương pháp vi sinh
- Tự phân: Canh trường sau LBR được ủ ở nhiệt độ 55 ± 1oC trong thời gian 24 giờ để nấm men tự phân hủy.
- Dùng chế phẩm chitinase với tỉ lệ 1% (ml/g) sau đó ủ ở nhiệt độ 55 ± 1oC trong thời gian 1 giờ, sau đó ủ tiếp ở 37oC trong thời gian 2 giờ.
Phương pháp kết hợp các phương pháp vật lý, hóa học và vi sinh
Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát phương pháp phá vỡ thành tế bào
Số TT Phương pháp Số TT Phương pháp NT 1
Tự phân - Nghiền NT 12 Lạnh đông - Rã đông - Tự phân- Nghiền - Siêu âm NT 2 Tự phân - Nghiền - Siêu âm NT 13 Lạnh đông - Rã đông - Siêu âm NT 3 Tự phân - Siêu âm NT 14 Cấp đông
NT 4 DMSO 1% NT 15 Cấp đông - Tự phân - Nghiền NT 5
DMSO 1% - Tự phân - Nghiền NT 16 Cấp Siêu âm đông - Tự phân - Nghiền - NT 6 DMSO 1% - Tự phân - Nghiền -
Siêu âm NT 17 Cấp đông - Rã đông - Tự phân - Nghiền NT 7 DMSO 1% ủ ở nhiệt độ thấp - Tự
phân - Nghiền - Siêu âm NT 18
Cấp đông - Rã đông - Tự phân - Nghiền - Siêu âm
NT 8 Lạnh đông NT 19 Cấp đông - Rã đông - Siêu âm NT 9 Lạnh đông - Tự phân - Nghiền NT 20 Chế phẩm chitinase - Ủ nhiệt NT 10 Lạnh đông - Tự phân - Nghiền -
Siêu âm NT 21
Chế phẩm chitinase - Ủ nhiệt - Nghiền
NT 11 Lạnh đông - Rã đông - Tự phân - Nghiền
Bố trí 21 nghiệm thức (NT) phá vỡ thành tế bào như mô tả trong bảng 2.2. Sau khi xử lý mẫu theo các NT đã trình bày, bổ sung vào 25 ml hỗn hợp hệ DM3, tiến hành chiết tách rồi ly tâm lạnh với tốc độ 4500 vòng/phút trong thời gian 10 phút. Thu dịch trong để xác định hàm lượng beta-carotene trong mẫu.
Đối với các mẫu cần phân tích bằng kỹ thuật HPLC, mẫu sẽ được gửi đến Trung tâm phân tích sắc ký Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia TP. HCM và Trung tâm Đào tạo và Phát triển sắc ký TP. HCM thực hiện.
Sau khi chọn được Rhodotorula làm chủng giống nghiên cứu chính và phương pháp phá vỡ thành tế bào hiệu quả, các nghiên cứu thực nghiệm tiếp theo được tiến hành theo sơ đồ tóm tắt như sơ đồ 2.1.
Sơđồ 2.1 Sơđồ khảo sát và thu nhận chế phẩm sinh học CR từRhodotorula
Ngâm Gạo tấm Hồ hóa Phối trộn Bã đậu nành, dầu Dung dịch dưỡng chất Thanh trùng LBR Rhodotorula pH nước ngâm: 3
Thời gian ngâm: 12 giờ
Cấy giống (cấp 2) + Tvà đốii ềưu kiu thành phện nuôi cần dinh dấy với hàm ưỡng mục tiêu là hàm lượng beta- carotene (ppm theo CK) + Khảo sát khả năng sinh tổng hợp sinh khối và các sản phẩm trao đổi chất Chế phẩm từ Rho.(CR)
+ Phân tích thành phần dinh dưỡng + Thử nghiệm tính an toàn trên chuột + Thử nghiệm hiệu quả lên năng suất và phẩm chất trứng trên gà đẻ + Xác định quan hệ giữa carotenoid tổng và năng suất trứng Hoạt hóa Rh. sp.3 Giống cấp 1 Gia nhiệt 50oC +Khảo sát sự tự phân +Thời gian gia nhiệt
2.2.2 Thành phần môi trường cơ bản cho quá trình LBR nấm men Rhodotorula 2.2.2.1 Thành phần môi trường cơ bản
Theo công bố của Jacob (1991) [80], nấm men Rhodotorula có khả năng LBR trên nguồn cơ chất cám mì. Kết quả nghiên cứu của Jacob cho thấy Rhodotorula có khả năng sử dụng nguồn glucid có nguồn gốc tinh bột và nguồn nitơ hữu cơ trong cám mì.
Do đó, với mục đích chọn nguồn cơ chất lên men rẻ tiền đồng thời phải là nguồn
nguyên liệu làm thức ăn cho gà nên thành phần cơ chất của môi trường cơ bản trong nghiên cứu này được đề xuất bao gồm các nguyên liệu gạo tấm, bã sắn và dầu.
Hình 2.1 Gạo tấm và bã đậu nành dùng trong nghiên cứu
- Gạo tấm: là cơ chất chính của quá trình LBR nấm men Rhodotorula. Gạo sử dụng trong nghiên cứu là loại gạo tấm thứ phẩm dùng trong chăn nuôi. Gạo tấm ngâm trong nước có pH 3 (dùng HCl 0,1N điều chỉnh pH) khoảng 12 giờ. Tỷ lệ gạo tấm: nước là 1: 1,2 đến 1,3 (Kg/lít) để đảm bảo hạt tấm sau khi hồ hóa không nhão và ướt.
- Bã đậu nành: sử dụng bã đậu nành phụ phẩm của Công ty cổ phần sữa Việt Nam (viết tắt Vinamilk). Nguyên liệu thu mua ở dạng khô, có màu vàng rơm và có mùi đặc trưng của đậu nành, quy cách đóng bao 25 Kg/bao. Thành phần gạo tấm và bã đậu nành sử dụng trong nghiên cứu như bảng 2.3.
- Dầu: sử dụng dầu cọ thô của Công ty TNHH Thương mại Denali, Malaysia.
Trên cơ sở nghiên cứu của Bensoussan L. và cs (1997) [22] và Lambraki M. và cs (1997) [92] khi khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng bổ sung vào cơ chất trong LBR, thành phần môi trường cơ bản (môi trường tổng hợp) ban đầu cho quá trình LBR
nấm men Rhodotorula được đề xuất bao gồm cơ chất và các chất dinh dưỡng bổ sung (gồm dung dịch khoáng chất và dầu cọ thô).
Bảng 2.3 Thành phần nguyên liệu sử dụng
Số TT Chỉ tiêu Gạo tấm (% Klg) Bã đậu nành (% Klg)
1 Chất khô (%) 86,90 86,46
2 Hàm lượng đạm tổng 6,70 42,57
3 Hàm lượng lipid 1,90 7,40
4 Dẫn xuất không đạm 72,60 24,65
5 Hàm lượng xơ thô 2,90 5,86
6 Hàm lượng tro tổng số 2,60 5,97
Để chuẩn bị 100 Kg môi trường cần sử dụng:
- Gạo tấm: 45 Kg
- Nước 55 đến 60 lít
- Bã đậu nành: 3 Kg
Sau khi hồ hóa gạo, phối trộn bã đậu nành lần lượt bổ sung vào 1% dung dịch các chất dinh dưỡng. Dung dịch các chất dinh dưỡng bổ sung có thành phần gồm NaNO3:10g; KH2PO4: 2,5g; MgSO4.7H2O: 1,75g; saccharose: 30g; nước cất: 1000 ml. Bổ sung thêm 1% dầu cọ thô (ml/g) vì theo Khaled M. và cs [87] các loại dầu thực vật có tác dụng làm tăng khả năng tổng hợp sắc tố và chất béo của nấm men Rhodotorula.
Phối trộn môi trường có thành phần như trên vào các khay lên men có kích thước 25 x 25 x15 cm, bề dày lớp cơ chất rắn trung bình 1,5 cm. Hấp khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121 ± 1oC, áp suất 1atm, thời gian 35 đến 40 phút.
2.2.2.2 Tuyển chọn chủng Rhodotorula có khả năng sinh tổng hợp beta-carotene cao trên môi trường cơ bản
Cấy cùng tỷ lệ giống và nuôi 8 chủng nấm men Rhodotorula phân lập được trên môi trường cơ bản và nuôi theo phương pháp LBR, so sánh hàm lượng beta-carotene của các chủng Rhodotorula và chọn ra chủng có khả năng sinh tổng hợp beta-carotene cao nhất trên môi trường bán rắn làm nguồn giống chính trong nghiên cứu này.
2.2.3 Tối ưu hàm lượng các chất dinh dưỡng cần bổ sung cho quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula theo qui hoạch thực nghiệm Box-Hunter 2.2.3.1 Tìm thí nghiệm tại tâm cho bài toán tối ưu hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh bổ sung
Dùng phương pháp cổ điển, khảo sát sơ bộ quá trình sinh tổng hợp beta-carotene ở các hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh bổ sung khác nhau để chọn điểm ở tâm cho giai đoạn quy hoạch thực nghiệm quay bậc hai của Box - Hunter.
Nuôi Rhodotorula trong môi trường cơ bản có thành phần như trình bày ở mục 2.2.2.1. Thay đổi nồng độ của yếu tố khảo sát theo từng mức biến thiên riêng, các thành phần còn lại như môi trường cơ bản. Tiến hành khảo sát lần lượt ảnh hưởng hàm lượng của saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh bổ sung đến quá trình sinh tổng hợp beta- carotene theo các mức biến thiên được trình bày như bảng 2.4.
Bảng 2.4 Mức khảo sát của hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh để tìm thí nghiệm tại tâm Các mức Saccharose (ppm) Nitơ (ppm) Phospho (ppm) Lưu huỳnh (ppm) Mức 1 4000 4000 1000 400 Mức 2 7000 6000 2000 700 Mức 3 10000 8000 3000 1000 Mức 4 13000 10000 4000 1300
Cố định các điều kiện ban đầu như sau: nhiệt độ nuôi cấy (nhiệt độ phòng thí nghiệm) 28 đến 32oC; độ ẩm tương đối của không khí 65 đến 75% RH; độ ẩm môi trường 60 ± 1%; pH 5,5 ± 0,05 và tỷ lệ giống trung bình 4 x 107 CFU/g MT để tiến hành thực nghiệm khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh bổ sung đến khả năng sinh tổng hợp beta-carotene. Từ thực nghiệm trên, xác định hàm lượng beta-carotene (ppm theo CK) trong canh trường ở ngày lên men thứ 7 để tìm ra điểm ở tâm cho bài toán qui hoạch thực nghiệm bậc 2 của Box - Hunter.
2.2.3.2 Ma trận thực nghiệm để tối ưu hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh cần bổ sung vào cơ chất
Tối ưu 4 yếu tố thành phần môi trường dinh dưỡng bổ sung theo phương pháp quy
hoạch thực nghiệm quay bậc hai của Box-Hunter [1] với hàm mục tiêu là hàm lượng beta-carotene (ppm theo CK) do nấm men tổng hợp được ở ngày lên men thứ 7. Sau khi tìm được thí nghiệm tại tâm, phương án thí nghiệm được thiết lập theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm quay bậc hai của Box-Hunter với hệ số cánh tay đòn sao α = 2 và số thí nghiệm ở tâm là 7. Thiết lập mô hình thí nghiệm và thí nghiệm theo mô hình như bảng 2.5. Tổng số có 31 TN gồm: 16 TN ma trận (TN 1 đến 16), 8 TN quay (TN 17 đến 24), 7 TN tại tâm (TN 25 đến 31) như bảng 2.5.
Bảng 2.5 Ma trận qui hoạch thực nghiệm 4 yếu tố theo phương án quay bậc 2
Số TN x1 x2 x3 x4Số TN x1 x2 x3 x4Số TN x1 x2 x3 x4Số TN x1 x2 x3 x4 1 -1 -1 -1 -1 9 -1 -1 -1 1 17 -2 0 0 0 25 0 0 0 0 2 1 -1 -1 -1 10 1 -1 -1 1 18 2 0 0 0 26 0 0 0 0 3 -1 1 -1 -1 11 -1 1 -1 1 19 0 -2 0 0 27 0 0 0 0 4 1 1 -1 -1 12 1 1 -1 1 20 0 2 0 0 28 0 0 0 0 5 -1 -1 1 -1 13 -1 -1 1 1 21 0 0 -2 0 29 0 0 0 0 6 1 -1 1 -1 14 1 -1 1 1 22 0 0 2 0 30 0 0 0 0 7 -1 1 1 -1 15 -1 1 1 1 23 0 0 0 -2 31 0 0 0 0 8 1 1 1 -1 16 1 1 1 1 24 0 0 0 2
Trong đó x1, x2, x3 và x4 lần lượt là các biến mã hoá của hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh. Các mức biến thiên của x1, x2, x3 và x4 được cho như bảng 2.6.
Bảng 2.6 Mức biến thiên hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh bổ sung
Các mức Saccharose (x1) Nitơ (x2) Phospho (x3) Lưu huỳnh (x4)
Mức cơ sở 7000 8000 3000 700
Khoảng biến thiên 1000 500 300 200
Mức trên (+) 8000 8500 3300 900
Dựa vào kết quả thực nghiệm để xây dựng phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng bổ sung đến khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men
Rhodotorula. Phương trình qui hoạch thực nghiệm có dạng:
y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b4x4 + b12x1x2 + b13x1x3 + b14x1x4 +b23x2x3 + b24x2x4 + b34x3x4 +b11x12 + b22x22 + b33x32 + b44x42
Hàm mục tiêu y: hàm lượng beta-carotene (ppm theo CK) ở ngày lên men thứ 7. Phương trình này là cơ sở để xác định giá trị tối ưu của bốn yếu tố ảnh hưởng nói trên.
2.2.4 Tối ưu điều kiện nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula
2.2.4.1 Xác định thí nghiệm tại tâm cho bài toán tối ưu điều kiện nuôi cấy
Cố định hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh tối ưu cần bổ sung tìm
được ở mục 2.2.3.2. Tiến hành LBR nấm men Rhodotorula và khảo sát ảnh hưởng của
ba yếu tố độ ẩm, độ dày của lớp môi trường và tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men Rhodotorula theo các mức như trên bảng 2.7. Mục đích các thí nghiệm này là để tìm thí nghiệm tại tâm cho bài toán tối ưu điều kiện LBR.
Bảng 2.7 Mức khảo sát độẩm, độ dày lớp môi trường và tỷ lệ giống để tìm thí nghiệm tại tâm
Các mức Độ ẩm (%) Độ dày lớp MT (cm) Tỷ lệ giống (CFU/g MT)
Mức 1 50 1 4 x 107
Mức 2 60 2 7 x 107
Mức 3 70 3 10 x 107
2.2.4.2 Ma trận thực nghiệm tối ưu điều kiện nuôi cấy
Bảng 2.8 Ma trận qui hoạch thực nghiệm tối ưu 3 yếu tố theo phương án toàn phần
Số TN x1 x2 x3 Số TN x1 x2 x3 1 -1 -1 -1 7 -1 1 1 2 1 -1 -1 8 1 1 1 3 -1 1 -1 9 0 0 0 4 1 1 -1 10 0 0 0 5 -1 -1 1 11 0 0 0 6 1 -1 1
Chọn phương pháp quy hoạch thực nghiệm TYT 23 để lập phương án thí nghiệm và tiến hành thí nghiệm theo phương án ở bảng 2.8. Số thí nghiệm ở tâm là 3. Với x1, x2 và x3 lần lượt là các biến mã hoá của độ ẩm, độ dày lớp môi trường và tỷ lệ giống. Các biến này có mức biến thiên như bảng 2.9.
Bảng 2.9 Mức biến thiên của các yếu tốđiều kiện nuôi cấy
Các mức Độ ẩm (%)
Độ dày môi trường (cm)
Tỷ lệ giống (CFU/g)
Mức cơ sở 60 2 7 x 107
Khoảng biến thiên 5,0 0,5 2 x 107