nấm men Rhodotorula
3.2.3.1 Tìm thí nghiệm tại tâm
a. Khảo sát ảnh hưởng của độẩm đến quá trình sinh tổng hợp beta-carotene
Thay đổi độ ẩm ban đầu của môi trường nuôi cấy theo các mức 50, 60 và 70% và khảo sát hàm lượng beta-carotene do Rhodotorula sinh tổng hợp ở ngày nuôi cấy thứ 7. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.12 (xem kết quả thống kê ở phụ lục 5.10.2.1).
Bảng 3.12 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene ở các mức độẩm ban đầu khác nhau Số TN Độ ẩm (%) Hàm lượng beta-carotene (ppm theo CK) 1 50 111,98 ± 10,45 c 2 60 235,86 ± 30,68 a 3 70 145,99 ± 35,28 b
(Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức = 0,05)
Hàm lượng beta-carotene do nấm men tổng hợp tăng cao khi môi trường có độ ẩm ban đầu là 60%. Ở nhiệt độ xác định và tại trạng thái cân bằng, mỗi loài vi sinh vật chỉ phát triển tốt tại một giá trị hoạt độ nước (aW) xác định nên có thể đây là mức độ ẩm có thể duy trì được giá trị aW thích hợp cho nấm men phát triển. Với môi trường có độ ẩm quá thấp hay quá cao đều gây bất lợi cho nấm men. Như vậy giá trị độ ẩm môi trường ban đầu là 60% được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
b. Khảo sát ảnh hưởng của độ dày lớp môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp beta-carotene
Cố định độ ẩm ở mức 60% để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của độ dày lớp môi trường
đến khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula. Kết quả khảo sát được
trình bày ở bảng 3.13 (xem kết quả phân tích thống kê ở phụ lục 5.10.2.2).
Bảng 3.13 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene ở các lớp môi trường có độ dày khác nhau
Số TN
Độ dày lớp môi trường (cm) Hàm lượng beta-carotene (ppm theo CK) 1 1 206,36 ± 16,04 b 2 2 226,05 ± 4,83 a 3 3 186,34 ± 5,70 c
(Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức = 0,05)
Không khí đóng vai trò rất quan trọng đến sự hình thành sắc tố ở nấm men và các vi sinh vật khác. Trong nuôi cấy nấm men, không khí được xem là yếu tố thiết yếu để chúng đồng hoá các chất, sinh sản, phát triển, tổng hợp sinh khối tế bào và carotenoid. Hiệu quả của không khí phụ thuộc vào từng loài vi sinh vật [59]. Tuy nhiên, việc tạo
nên độ thoáng khí là vấn đề khó khăn thường gặp trong kỹ thuật LBR [107, 151]. Trong điều kiện nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm, để chọn ra chế độ thoáng khí thích hợp cho nấm men nên nghiên cứu này chỉ tiến hành khảo sát chọn độ dày thích hợp của lớp môi trường nuôi cấy trong các khay lên men. Nếu độ dày lớp môi trường quá mỏng sẽ tạo ra giá trị hoạt độ nước không thích hợp cho nấm men. Ngược lại, khi bề dày lớp môi trường lớn, nấm men phát triển không tốt do các nấm men ở sâu bên trong lớp cơ chất rắn không đủ oxi để hô hấp, đồng thời sự tích tụ nhiệt làm tăng hàm ẩm nên nấm men chỉ phát triển cục bộ trên bề mặt cơ chất. Khi độ dày của lớp môi trường vừa phải sẽ duy trì giá trị aW thích hợp và mức độ khuếch tán của oxi đến bề mặt cơ chất vừa đủ để nấm men phát triển. Do đó, lớp môi trường có bề dày 2 cm được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
c. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống ban đầu đến quá trình sinh tổng hợp beta- carotene của nấm men Rhodotorula
Cố định độ ẩm môi trường nuôi cấy là 60%, bề dày lớp môi trường là 2 cm và thay đổi tỷ lệ giống cấy khác nhau kết quả thu được như bảng 3.14.
Bảng 3.14 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene ở các tỷ lệ giống khác nhau
Số TN Tỷ lệ giống (CFU/g MT) Hàm lượng beta-carotene (ppm theo CK) 1 4 x107 235,79 ± 8,33 b 2 7 x107 251,68 ± 8,12 a 3 10 x107 243,86 ± 7,70 ab
(Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức = 0,05)
Khi tăng tỷ lệ giống, hàm lượng beta-carotene cũng tăng theo. Tuy nhiên, khi tỷ lệ giống cấy ở mức cao nhất (10 x 107 CFU/g MT) nhưng hàm lượng beta-carotene thu được không khác biệt ở mức ý nghĩa = 0,05 (xem số liệu ở phụ lục 5.10.2.3) so với 2 mức giống còn lại. Tỷ lệ giống tăng mạnh nhưng hàm lượng beta-carotene do nấm men sinh tổng hợp không tăng là do thành phần các chất dinh dưỡng bổ sung trong môi
trường LBR không đủ cung cấp cho số lượng lớn nấm men sử dụng và thực hiện các quá trình trao đổi chất.
Kết luận chọn tỷ lệ giống là 7 x 107 CFU/g làm thí nghiệm tại tâm cho bài toán tối ưu điều kiện nuôi cấy.
Như vậy, với kết quả thực nghiệm nhận được ở trên, các điều kiện nuôi cấy ở tâm cho bài toán thực nghiệm tối ưu với 3 yếu tố điều kiện nuôi cấy được xác định như sau:
Độ ẩm môi trường = 60%
Độ dày lớp môi trường = 2 cm
Tỷ lệ giống = 7 x 107 CFU/g môi trường
3.2.3.2 Tối ưu toàn phần các yếu tốđiều kiện nuôi cấy bán rắn
- Phương trình hồi qui
Bảng 3.15 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula từ thực nghiệm tối
ưu điều kiện nuôi cấy TN Độ ẩm (%) Độ dày của lớp môi trường (cm) Tỷ lệ giống (CFU/g) Hàm lượng beta-carotene (ppm theo CK) Lần 1 Lần 2 1 55 1,5 5 x 107 128,81 131,24 2 65 1,5 5 x 107 166,91 175,09 3 55 2,5 5 x 107 176,87 172,97 4 65 2,5 5 x 107 228,10 230,37 5 55 1,5 9 x 107 250,79 244,10 6 65 1,5 9 x 107 268,01 272,16 7 55 2,5 9 x 107 151,31 148,95 8 65 2,5 9 x 107 252,75 249,45 9 60 2 7 x 107 239,69 241,02 10 60 2 7 x 107 214,48 208,61 11 60 2 7 x 107 235,77 243,70
Các điều kiện nuôi cấy của thí nghiệm tại tâm được sử dụng để tiến hành tối ưu các yếu tố độ ẩm, độ dày của lớp môi trường và tỷ lệ giống cấy trên cơ sở cố định hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh tối ưu cần bổ sung đã xác định được ở mục 3.2.2. Chọn phương pháp quy hoạch thực nghiệm TYT 23 để lập phương án thí nghiệm
và tiến hành thí nghiệm theo phương án này. Từ kết quả khảo sát thể hiện ở các bảng 3.12, 3.13, 3.14, chọn khoảng biến thiên thích hợp của các yếu tố và chọn các mức biến thiên như bảng 2.9. Thiết lập mô hình thí nghiệm và thí nghiệm theo mô hình. Kết quả nhận được trình bày ở bảng 3.15. Các công thức tính toán tối ưu xem phụ lục 5.5.2 và số liệu thô xem phụ lục 5.10.2.5. Theo các số liệu ở bảng 3.15 và công thức (9) và (10) ở phụ lục 5.5.2, các giá trị bj tính được như bảng 3.16.
Bảng 3.16 Các hằng số bj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu điều kiện nuôi cấy
b0 b1 b2 b3 b12 b13 b23 b123
202,99 27,36 -1,64 26,70 11,46 3,54 -27,43 8,13
Theo các số liệu ở bảng 3.16 và công thức (3) ở phụ lục 5.5.1 và (11) ở phụ lục 5.5.2 sẽ tính được các giá trị tj như trong bảng 3.17.
Bảng 3.17 Các hệ số hồi qui tj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu điều kiện nuôi cấy
t0 t1 t2 t3 t12 t13 t23 t123
34,87 4,70 -0,28 4,59 1,97 0,61 4,71 1,40
Tra bảng tp(f) theo tiêu chuẩn Student với p = 0,05; f = n0 – 1 = 3 - 1 = 2 nhận được: t0,05(2) = 4,3. So sánh các giá trị tj với t0,05(f), kết quả cho thấy t2, t12, t13 và t123 nhỏ hơn t0,05(2). Do đó, các hệ số b2, b12, b13, b123 bị loại ra khỏi phương trình hồi qui.
Vậy phương trình hồi qui có dạng:
Y2 = 202,99 + 27,36 x1 + 26,70 x3- 27,43 x2 x3
- Kiểm định sự tương thích của phương trình hồi qui
Bảng 3.18 Các phương sai và F được suy ra từ các số liệu thực nghiệm tối ưu điều kiện nuôi cấy
Sdư Sth stt2 sth2 F
19409,57 542,36 4852,39 271,18 17,89
Theo các số liệu ở phụ lục 5.10.2.5 và các công thức (3), (4), (5), (6), (7) và (12) ở phụ lục 5.5 tính được các giá trị phương sai và F như ở bảng 3.18. Tra bảng F1-p(f1, f2) theo tiêu chuẩn Fisher với p = 0,05, f1 = N – l = 8 - 4 = 4; f2 = n0 – 1= 3 - 1 = 2, trong đó l là hệ số có ý nghĩa trong phương trình hồi qui. Tra bảng tiêu chuẩn Fisher nhận được
F0,95(4,2) = 19,3. Theo bảng 3.18 có giá trị F = 17,89 < F0,95 (4,2) = 19,3. Do đó phương trình hồi qui nhận được tương thích với thực nghiệm.
Phương trình hồi qui nhận được cho thấy 3 yếu tố: độ ẩm, độ dày lớp môi trường và tỷ lệ giống đều ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men
Rhodotorula. Trong đó, độ ẩm và tỷ lệ giống ảnh hưởng tỷ lệ thuận còn tương tác kép giữa độ dày lớp môi trường và tỷ lệ giống ảnh hưởng tỷ lệ nghịch. Điều này hoàn toàn phù hợp với thực tế. Trong hai yếu tố ảnh hưởng tỷ lệ thuận, độ ẩm là yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến hàm lượng beta-carotene của nấm men. Vì vậy, để tăng hàm lượng beta-carotene cần tăng giá trị độ ẩm ban đầu nhằm duy trì giá trị hoạt độ aW thích hợp cho nấm men phát triển. Với phương trình hồi qui nhận được có thể xác định được các thông số điều kiện LBR nấm men Rhodotorula như độ ẩm, độ dày lớp môi trường và tỷ lệ giống theo lý thuyết, đồng thời qua đó có thể điều khiển các thông số trên. - Xác định điểm tối ưu
Tiến hành tối ưu theo phương pháp tìm cực trị bằng cách sử dụng công cụ Optimizer của phần mềm Modde 5.0 để tìm các thông số công nghệ tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men Rhodotorula, kết quả thu được là:
Y2max = 283,21 ppm beta-carotene (theo CK)
Các điểm tối ưu:
Độẩm = 65%
Độ dày lớp môi trường = 1,5 cm
Tỷ lệ giống = 9 x 107 CFU/g môi trường
Như vậy, với cơ chất chính và các các chất dinh dưỡng bổ sung như đã tiến hành thực nghiệm, trong phạm vi các yếu tố điều kiện nuôi cấy ban đầu đã chọn thì hàm lượng beta-carotene ở ngày lên men thứ 7 đạt cực đại khi độ ẩm là 65%, độ dày lớp môi trường là 1,5 cm và tỷ lệ giống là 9 x 107 CFU/g môi trường.
So sánh kết quả tối ưu giai đoạn này (Y2 max = 283,21 ppm) với giai đoạn đầu khi chỉ tối ưu các yếu tố dinh dưỡng (Y1 max = 238,29 ppm), kết quả cho thấy hàm lượng beta-
carotene tăng lên 18,85% so với khi chưa tiến hành tối ưu các yếu tố điều kiện nuôi cấy bán rắn. Kết quả này chứng tỏ việc tối ưu các thông số kỹ thuật trong quá trình LBR có ý nghĩa rất lớn trong thực tế sản xuất.
3.2.4 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp sinh khối, phytase, carotenoid tổng và beta-carotene của nấm men Rhodotorula theo thời gian
Trong các thí nghiệm này, các kết quả tối ưu các chất dinh dưỡng bổ sung (mục 3.2.2) và điều kiện nuôi cấy (mục 3.2.3) được sử dụng để tiến hành khảo sát khả năng sinh tổng hợp sinh khối, hoạt độ phytase, carotenoid tổng và beta-carotene do nấm men
Rhodotorula tổng hợp theo thời gian LBR.
3.2.4.1 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp sinh khối
Tiến hành khảo sát khả năng sinh tổng hợp sinh khối nấm men trên môi trường LBR bằng phương pháp đếm khuẩn lạc theo Sato và cs (theo mục 2.2.5.3), đồ thị nhận được trình bày ở hình 3.7 (số liệu thô và cách tính trình bày ở phụ lục 5.10.3.1).
0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Thời gian (ngày) S inh k h ố i ( lg (CF U/ g C K )
Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn khả năng sinh tổng hợp sinh khối của Rhodotorula theo thời gian
Đồ thị hình 3.7 mô tả khái quát hình thức phát triển của nấm men trong quá trình LBR. Ở 3 ngày đầu, nấm men sinh trưởng chậm do phải thích nghi với điều kiện LBR nên khả năng sinh tổng hợp sinh khối thấp. Từ ngày thứ 4, sau khi đã thích nghi và trưởng thành các tế bào sinh sản mạnh nên tốc độ sinh tổng hợp sinh khối tăng lên rõ rệt. Ở ngày nuôi cấy thứ 6 và 7, số lượng tế bào đạt cực đại và đây chính là thời gian nấm
men Rhodotorula ở vào giai đoạn ổn định. Vào ngày thứ 8, số lượng tế bào bắt đầu giảm mạnh do nấm men không đủ các chất dinh dưỡng để thực hiện các quá trình trao đổi chất và đây chính là thời điểm các tế bào đã bước vào giai đoạn suy vong của quá trình sinh trưởng.
3.2.4.2 Khảo sát hoạt tính phytase theo thời gian
Thí nghiệm theo mục 2.2.5.6. Công thức tính và cách tiến hành ở phụ lục 5.2.9. Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của Rhodotorula theo thời gian nuôi cấy (xem số liệu ở phụ lục 5.10.3.2) được thể hiện ở biểu đồ 3.8.
Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh tổng hợp phytase theo thời gian
Tiến hành khảo sát hoạt tính phytase của nấm men theo thời gian nuôi cấy, kết quả cho thấy nấm men Rhodotorula phân lập được có khả năng sinh tổng hợp phytase với hoạt tính tương đối cao. Kết quả này phù hợp với công bố của Bindu S. và cs (1998) [30] về khả năng sinh tổng hợp phytase của nấm men Rhodotorula graminis khi nuôi cấy theo phương pháp lên men chìm. Theo biểu đồ ở hình 3.8, Rhodotorula có hoạt độ phytase đạt cực đại vào ngày nuôi cấy thứ 6 và sau đó hoạt độ phytase giảm dần theo thời gian. Hiện tượng này là do các chất dinh dưỡng trong môi trường LBR vào thời điểm này giảm mạnh, gây ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của nấm men.
Theo Raimbault M. và cs (1997) [118] khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất (trong đó có enzyme) của vi sinh vật trong LBR thường cao hơn so với lên men chìm. Việc phân lập được nấm men Rhodotorula có khả năng tổng hợp phytase có ý
nghĩa thực tiễn rất quan trọng khi sử dụng canh trường LBR làm thức ăn cho gà đẻ trứng. Khi đó chế phẩm sinh học thu được từ nấm men Rhodotorula sẽ giúp gà hấp thu tốt các chất dinh dưỡng, đặc biệt làm tăng hàm lượng phospho, canxi trong xương đồng thời góp phần làm giảm thiểu lượng phospho trong phân, hạn chế gây ô nhiễm môi trường chăn nuôi.
3.2.4.3 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp carotenoid tổng và beta-carotene theo thời gian
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp carotenoid tổng và beta-carotene của Rhodotorula
(theo mục 2.2.5.4 và 2.2.5.5)theo thời gian tại các điều kiện tối ưu. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.19 (xem số liệu và phân tích anova ở phụ lục 5.10.3.3 và 5.10.3.4).
Bảng 3.19 Kết quả xác định hàm lượng beta-carotene, carotenoid tổng theo thời gian LBR Số TT Thời gian khảo sát Hàm lượng beta-carotene (ppm theo CK) % carotenoid Carotenoid tổng (mg/ 100 g CK) 1 Ngày 2 87,23 ± 2,86g 45,49 ± 7,86b 19,27 ± 3,28 f 2 Ngày 3 130,55 ± 4,69 f 36,09 ± 3,30c 36,24 ± 4,48e 3 Ngày 4 170,73 ± 7,57e 21,08 ± 1,77d 81,03 ± 3,23c 4 Ngày 5 219,13 ± 8,64c 17,95 ± 0,99d 122,07 ± 1,91b 5 Ngày 6 261,93 ± 16,84b 19,40 ± 2,24d 135,13 ± 7,11a 6 Ngày 7 275,46 ± 5,11a 20,95 ± 0,96d 131,51 ± 4,26a 7 Ngày 8 280,19 ± 8,40a 48,05 ± 3,30b 58,37± 5,09d 8 Ngày 9 206,57 ± 9,89d 56,75 ± 6,91a 36,48 ± 3,99e
(Các giá trị trong cùng một cột có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức = 0,05)
So sánh khả năng sinh tổng hợp beta-carotene và carotenoid tổng của Rhodotorula theo thời gian LBR thu được đồ thị thể hiện ở hình 3.9. Đồ thị này cho thấy nấm men
Rhodotorula tổng hợp carotenoid tổng và beta-carotene không tương thích nhau. Hàm lượng carotenoid tổng đạt cực đại vào ngày thứ 7 trùng với thời điểm nấm men sinh tổng hợp sinh khối cực đại. Trong khi đó, beta-carotene đạt cực đại vào ngày thứ 8. Hàm lượng beta-carotene giữa ngày thứ 7 và ngày thứ 8 không khác biệt ở mức ý nghĩa
= 0,05 (xem phụ lục 5.10.3.4) với giá trị lần lượt là 275,46 ± 5,11 và 280,19 ± 8,40 ppm (theo CK). Sinh khối tế bào và carotenoid đạt cực đại vào ngày thứ 7 và tại thời điểm này hàm lượng beta-carotene chỉ chiếm 20,95 ± 0,96% carotenoid tổng.
0 50 100 150 200 250 300 2 3 4 5 6 7 8 9 Hà m l ượ ng be ta -c ar ot en e (p pm th eo C K ) 0.000 20.000 40.000 60.000 80.000 100.000 120.000 140.000 160.000 Thời gian (ngày) Hà m l ượ ng carot en oi d (m g% C K ) Beta-carotene Carotenoid
Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn khả năng sinh tổng hợp beta-carotene và carotenoid tổng theo thời gian
Bên cạnh đó, thực nghiệm khảo sát cho thấy ngoài beta-carotene, Rhodotorula còn sinh tổng hợp một lượng lớn các carotenoid khác và theo Kurtzman C. và cs [91], các