Tiến hành thí nghiệm khảo sát hệ dung môi trích ly và bước sóng tại đó dung dịch có
độ hấp thu cực đại. Kết quả này (xem số liệu thực nghiệm và đồ thị ở phụ lục 5.7.3)
cho thấy mỗi hệ dung môi sẽ có độ hấp thu cực đại tại các bước sóng khác nhau. Khi sử dụng hệ dung môi trích ly là DM2 và DM5 cho độ hấp thu cực đại ODmax tại bước sóng lần lượt là 457 và 458 nm. Các DM1, DM3 và DM4 đều có ODmax tại bước sóng
= 454 nm, trong đó DM3 có giá trị OD lớn nhất và có ý nghĩa khác biệt so với các hệ dung môi khác ở cùng nồng độ chất chuẩn. Hệ DM3 có khả năng hòa tan tốt beta- carotene so với các hệ dung môi khảo sát. Theo Rodney F. B. (1993) [125], beta- carotene trong dung môi không phân cực diethyl ether có độ hấp thu cực đại max = 449,8 nm nhưng trong dung môi phân cực acetone lại có độ hấp thu cực đại tại max = 454 nm. Như vậy, kết quả khảo sát thu được max của beta-carotene trong hệ DM3 và trong dung môi acetone là như nhau và bằng 454 nm. Nghiên cứu của Bhosale P. và cs (2003) [29] cũng dùng hệ DM3 để tách carotenoid từ Rhodotorula glutinis NCIM 3353 bằng phương pháp HPLC nhưng tại bước sóng max = 457 nm.
Kết quả chọn hệ dung môi DM3 gồm acetonitrile: 2-propanol: ethyl acetate = 40: 40: 20 (theo thể tích) và bước sóng max = 454 nm để xác định hàm lượng beta-carotene trong các bước nghiên cứu tiếp theo.
3.2.1.2 Dựng đường chuẩn beta-carotene trong hệ dung môi DM3
Chất chuẩn beta-carotene của Sigma Chemical Co.( Mỹ) có mã số C9750-5G được pha thành các dung dịch có nồng độ 5, 10, 15, 20 và 30 ppm trong hệ DM3. Tiến hành thí nghiệm như mục 2.2.1.2 và dựng được đường chuẩn có dạng y = 14,152 x (xem đồ thị đường chuẩn ở phụ lục 5.7.4), trong đó y là hàm lượng beta-carotene (ppm) và x là mật
độ quang OD. Phương trình này được sử dụng để xác định hàm lượng beta-carotene
trong các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp quang phổ UV-Vis.
3.2.1.3 Phương pháp phá vỡ thành tế bào hiệu quả để xác định hàm lượng beta- carotene
thuật như mục 2.2.1.3 và bố trí thí nghiệm như bảng 2.2. Lấy mẫu canh trường ở ngày nuôi cấy thứ 7 để tiến hành xác định hàm lượng beta-carotene theo 21 nghiệm thức (NT) phá vỡ tế bào (xem mục 2.2.1.3) bằng hệ dung môi DM3. Kết quả thu được trình bày ở biểu đồ 3.6 (số liệu thí nghiệm và phân tích anova ở phụ lục 5.9).
Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng beta-carotene thu được theo các phương pháp phá vỡ tế bào
Hiện nay, đã có nhiều công bố khoa học [25-27, 36, 56, 114, 145] về phương pháp thu nhận sinh khối và tách chiết sắc tố carotenoid cũng như beta-carotene của Rhodotorula
được nuôi cấy theo kỹ thuật lên men chìm. Nghiên cứu nuôi cấy Rhodotorula trên môi
trường rắn và phá vỡ tế bào nấm men có lẫn trong các hạt cơ chất rắn là một nghiên cứu hoàn toàn mới chưa được đề cập bất kỳ trong một công trình nào. Việc tách sinh khối ra khỏi cơ chất có cấu trúc xơ hay hạt là rất khó nên mục tiêu của thí nghiệm này là tìm ra cách phá vỡ thành tế bào có hiệu quả cao để tách chiết sắc tố nội bào trong điều kiện tế bào nấm men Rhodotorula lẫn trong các hạt cơ chất rắn.
Từ kết quả thực nghiệm thu được, chúng tôi đưa ra một số nhận xét sau:
- Với các NT phá tế bào bằng phương pháp tự phân và nghiền với bột thủy tinh
Phương pháp tự phân và nghiền với bột thủy tinh là phương pháp phổ biến thường dùng để phá vỡ tế bào khi thu nhận enzyme hay sắc tố nội bào trong phòng thí nghiệm. Phương pháp này chỉ thích hợp với một lượng nhỏ tế bào đã được tách ra khỏi môi nuôi cấy. Do tế bào còn lẫn trong cơ chất rắn dạng hạt nên phương pháp tự phân và nghiền với bột thủy tinh cho hiệu suất tách chiết không cao do cơ chế tác động của bột
thủy tinh lên tế bào không triệt để. Đồng thời, cơ năng tác động lên mẫu trong quá trình nghiền một phần biến thành nhiệt năng làm thất thoát beta-carotene. Tuy nhiên, nếu kết hợp với làm lạnh trong quá trình nghiền mẫu thì có thể khắc phục sự thất thoát beta- carotene do tác động của nhiệt độ.
- Với các NT phá tế bào bằng dung môi DMSO và chế phẩm chitinase
Theo Diego và cs (2006) [48], dung môi DMSO có khả năng phá vỡ mạnh thành tế bào
Rhodotorula để tách chiết sắc tố carotenoid. DMSO là hợp chất hữu cơ có khả năng hoà tan hay tác dụng với các chất trong tế bào chất tạo ra các lỗ thủng trên thành tế bào nên có tác dụng tách chiết các chất bên trong tế bào. DMSO có thể chỉ có tác dụng tốt đối với sinh khối tế bào được tách ra từ quá trình lên men chìm. Với LBR, sinh khối còn lẫn trong các hạt cơ chất rắn nên hiệu quả phá vỡ tế bào của DMSO (NT4) không cao, chỉ đạt 16,87% so với NT13. Nếu sử dụng DMSO kết hợp với sử dụng sóng siêu âm có bổ sung bột thuỷ tinh (NT7), có thể đạt 77,29% so với NT13. Chế phẩm chitinase có tác dụng phá vỡ thành tế bào cao hơn so với DMSO. Việc sử dụng chitinase để phá vỡ thành tế bào là phương pháp có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao vì đây là hợp chất tương thích sinh học. Tuy nhiên, kết quả khảo sát cho thấy khi dùng DMSO hay chitinase đều cần kết hợp với phương pháp nghiền cơ học hoặc sóng siêu âm thì hiệu quả phá vỡ tế bào mới được cải thiện đáng kể.
- Với các NT phá tế bào bằng phương pháp lạnh đông và rã đông
Các NT liên quan đến xử lý lạnh đông luôn cho kết quả phá vỡ thành tế bào cao hơn các NT qua cấp đông. Ở nhiệt độ -5oC đến -1oC của quá trình lạnh đông, gần như đa số nước tự do có trong mẫu kết tinh thành nước đá với tinh thể to và sắc nên khi rã đông ở nhiệt độ 55 ± 1oC các tinh thể đá này sẽ đâm thủng thành tế bào mạnh hơn so với phương pháp cấp đông nên có khả năng phá vỡ thành tế bào tốt hơn. Phương pháp lạnh đông không tiêu tốn nhiều năng lượng như phương pháp cấp đông nhưng cho hiệu quả phá vỡ tế bào cao, do đó hàm lượng beta-carotene xác định được cao hơn. Phương pháp lạnh đông và rã đông được xem là phương pháp phổ biến để phá vỡ thành tế bào trong các nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.
- Với các NT có xử lý tế bào bằng sóng siêu âm
Qua bảng 3.4 cho thấy hàm lượng beta-carotene ở các NT có qua xử lý tế bào bằng sóng siêu âm luôn cao hơn so với các NT khác. Kết quả thí nghiệm cho thấy dùng sóng siêu âm là phương pháp phá vỡ tế bào nhanh và hiệu quả, trong đó ở NT13 hàm lượng beta-carotene thu được đạt giá trị cao nhất.
Phương pháp phá tế bào bằng sóng siêu âm có bổ sung bột thủy tinh luôn cho hiệu quả cao hơn so với trường hợp không bổ sung bột thủy tinh. Đây được xem là phương pháp hiệu quả vì bột thủy tinh sẽ hỗ trợ rất tốt cho các tia sóng len lỏi vào bên trong tế bào. Như vậy, kết quả khảo sát thu được cho thấy phương pháp xử lý nhiệt (lạnh đông - rã
đông) kết hợp với sóng siêu âm trong hệ dung môi có bổ sung bột thủy tinh là phương
pháp phá vỡ thành tế bào cao nhất trong điều kiện tế bào lẫn trong các hạt cơ chất rắn. Do đó, NT13 tương ứng với phương pháp lạnh đông - rã đông - siêu âm được chọn làm nghiệm thức để phá vỡ thành tế bào trong các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2 Tối ưu hàm lượng các chất dinh dưỡng bổ sung cho quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula beta-carotene của Rhodotorula
3.2.2.1 Khảo sát thí nghiệm tại tâm của hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh bổ sung
Với thành phần môi trường cơ bản như mục 2.2.2.1, tiến hành nghiên cứu theo quy trình như sơ đồ 2.1 và thí nghiệm được bố trí theo bảng 2.4 để tìm thí nghiệm tại tâm của các hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh cần chất bổ sung vào môi trường. Số liệu phân tích thống kê anova được thể hiện ở phụ lục 5.10.1.
a. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men Rhodotorula
Tiến hành khảo sát lần lượt ảnh hưởng của hàm lượng saccharose bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các mức 4000, 7000, 10000 và 13000 (ppm), các thành phần khác như môi trường cơ bản. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.4 (xem số liệu ở phụ lục 5.10.1.1).
Bảng 3.4 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm lượng saccharose khác nhau Số TN Hàm lượng saccharose (ppm) Hàm lượng beta-carotene (ppm theo CK) 1 4 000 120,11 ± 7,51 b 2 7 000 133,40 ± 6,62 a 3 10 000 115,77 ± 2,83 b 4 13 000 96,21 ± 15,29 c
(Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức = 0,05)
Nguồn glucid có ý nghĩa hàng đầu trong sự sống của vi sinh vật. Cơ chất chính mà nấm men sử dụng LBR trong nghiên cứu này là gạo tấm. Nguyên liệu gạo tấm chỉ được xử lý sơ bộ bằng cách ngâm trong dung dịch có pH acid và hồ hoá, không qua quá trình đường hóa nên nấm men sẽ khó đồng hóa glucid dưới dạng tinh bột. Theo tài liệu tổng quan được [37-39, 144], nhiều nấm men Rhodotorula có khả năng sử dụng các nguồn glucid mạch dài như bột mì, bột bắp, dịch chiết bột đậu nành, dịch chiết bột ngô. Trong nghiên cứu này, với Rhodotorula phân lập được và với môi trường sử dụng ở dạng hạt rắn nên nấm men khó sử dụng ở giai đoạn đầu. Việc cung cấp thêm glucid dưới dạng saccharose là rất cần thiết, nó sẽ giúp nấm men thích nghi và tăng trưởng nhanh, rút ngắn thời gian nuôi cấy. Kết quả khảo sát cho thấy nguồn saccharose bổ sung có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng phát triển và tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula. Khi tăng hàm lượng saccharose, khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men
Rhodotorula tăng lên rõ rệt. Tuy nhiên, tốc độ tăng trưởng của nấm men còn phụ thuộc vào sự hấp thu chất dinh dưỡng trong giới hạn áp suất thẩm thấu của môi trường và nồng độ tế bào. Khi hàm lượng saccharose tăng quá cao sẽ gây ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm men.
Hàm lượng saccharose bổ sung là 7000 ppm được chọn để khảo sát các thí nghiệm tại tâm cho thực nghiệm tối ưu dinh dưỡng.
b. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến khả năng sinh tổng hợp beta- carotene của nấm men Rhodotorula
Cố định hàm lượng saccharose ở mức 7000 ppm để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nitơ vô cơ bổ sung (dưới dạng muối NaNO3) đến khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.5 (xem số liệu ở phụ lục 5.10.1.2).
Bảng 3.5 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm lượng nitơkhác nhau Số TN Hàm lượng nitơ (ppm) Hàm lượng beta-carotene (ppm theo CK) 1 4 000 138,74 ± 5,77 bc 2 6 000 145,07 ± 2,41b 3 8 000 153,95 ± 6,76 a 4 10 000 136,48 ± 8,30 c
(Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức = 0,05)
Nitơ là nguyên tố quan trọng thứ hai (sau glucid) để cấu thành nên tế bào. Ý nghĩa chủ yếu của các chất dinh dưỡng chứa nitơ đối với vi sinh vật là ở chỗ chúng cung cấp nitơ
để tạo ra các nhóm amin (-NH2) và nhóm imin (-NH-) trong các phân tử acid amin, các
nucleotide purine và pyrimidin, các vitamin và một số hợp chất khác có trong nguyên sinh chất của tế bào. Trong nuôi cấy vi sinh vật, người ta thường sử dụng nguồn nitơ vô cơ dưới dạng NaNO3, NH4NO3, (NH4)2SO4 hay urea. Với nghiên cứu này, nguồn nitơbổ sung ở dạng NaNO3 dễ hấp thu và không có hại với vi sinh vật. Kết quả thí nghiệm thể hiện trong ở bảng 3.5 cho thấy hàm lượng beta-carotene đạt cực đại khi hàm lượng nitơvôcơ bổ sung ở mức 8000 ppm. Như vậy, hàm lượng nitơ bổ sung ở mức 8000 ppm được chọn để thực hiện thí nghiệm tại tâm.
c. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng phospho đến khả năng sinh tổng hợp beta- carotene của nấm men Rhodotorula
Cố định hàm lượng saccharose là 7000 và nitơ là 8000 (ppm). Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nguồn phospho vô cơ bổ sung dưới dạng muối KH2PO4 đến khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men Rhodotorula. Kết quả nhận được như thể hiện ở bảng 3.6 (xem số liệu ở phụ lục 5.10.1.3).
Bảng 3.6 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm lượng phospho khác nhau Số TN Hàm lượng phospho (ppm) Hàm lượng beta-carotene (ppm theo CK) 1 1 000 133,54 ± 7,36 d 2 2 000 147,13 ± 5,25 b 3 3 000 169,87 ± 2,99 a 4 4 000 140,90 ± 2,86 c
(Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức = 0,05)
Muối KH2PO4 được dùng làm nguồn cung cấp khoáng bổ sung vào môi trường cơ bản với mục đích chủ yếu cung cấp nguồn phospho vô cơ, ngoài ra nó còn cung cấp nguồn kali cho nấm men. Khi hàm lượng phospho bổ sung tăng, hàm lượng beta-carotene cũng tăng dần và khi hàm lượng phospho đạt đến một mức nhất định thì hàm lượng beta-carotene đạt cực đại. Hàm lượng beta-carotene đạt cực đại khi hàm lượng phospho bổ sung ở mức 3000 ppm. Tuy nhiên, khi hàm lượng phospho tiếp tục tăng cao thì hàm lượng beta-carotene thu được giảm (từ 169,87 ± 2,99 giảm còn 140,90 ± 2,86 ppm). Khi nồng độ muối KH2PO4 cao gây ra sự bất lợi cho tế bào, làm nấm men bị ức chế và phát triển kém. Do đó hàm lượng phospho bổ sung ở mức 3000 ppm được chọn để thực hiện thí nghiệm tại tâm tiếp theo.
d. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng lưu huỳnh đến khả năng sinh tổng hợp beta- carotene của nấm men Rhodotorula
Cố định hàm lượng các chất dinh dưỡng bổ sung như sau saccharose: 7000, nitơ vô cơ: 8000 và phospho: 3000 (ppm) và tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nguồn lưu huỳnh bổ sung đến khả năng sinh tổng hợp beta-catotene của Rhodotorula. Kết quả khảo sát
được trình bày ở bảng 3.7 (xem số liệu ở phụ lục 5.10.1.4). Kết quả này cho thấy khi
hàm lượng lưu huỳnh bổ sung tăng, hàm lượng beta-carotene cũng tăng dần và khi hàm lượng lưu huỳnh bổ sung tăng đến một giới hạn nhất định thì hàm lượng beta-carotene sẽ tăng mạnh. Hàm lượng beta-carotene đạt cực đại khi hàm lượng lưu huỳnh ở mức 700 (ppm). Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng hàm lượng lưu huỳnh thì hàm lượng beta-
carotene thu được giảm đáng kể (từ 184,42 ± 9,82 giảm còn 163,14 ± 13,53 ppm). Bản chất của hiện tượng trên là do muối MgSO4.7H2O ngoài việc cung cấp lưu huỳnh cho nấm men tổng hợp các acid amin thiết yếu như cystein, methionine nó còn cung cấp magnesium cho nấm men phát triển. Tuy nhiên, mỗi nấm men chỉ cần một lượng khoáng ở một nồng độ nhất định. Nếu hàm lượng MgSO4.7H2O cung cấp quá cao, nấm men sẽ phát triển kém do đó khả năng tổng hợp beta-carotene cũng giảm theo. Bảng 3.7 cho thấy hàm lượng beta-carotene đạt giá trị cực đại khi hàm lượng lưu huỳnh bổ sung là 700 (ppm) và giá trị này được chọn để khảo sát thí nghiệm tại tâm.
Bảng 3.7 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm lượng lưu huỳnh khác nhau
Số TN
Hàm lượng lưu huỳnh (ppm) Hàm lượng beta-carotene (ppm theo CK) 1 400 171,00 ± 14,18 b 2 700 184,42 ± 9,82 a 3 1000 163,14 ± 13,53 b 4 1300 133,72 ± 2,05 c
(Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức = 0,05)
Tóm lại, với kết quả thực nghiệm nhận được ở trên, các hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh ở tâm cho thực nghiệm tối ưu với 4 yếu tố dinh dưỡng cần bổ sung xác định được là:
- Hàm lượng saccharose = 7 000 (ppm) - Hàm lượng nitơ = 8 000 (ppm) - Hàm lượng phospho = 3 000 (ppm) - Hàm lượng lưu huỳnh = 700 (ppm)
3.2.2.2 Hàm lượng saccharose, nitơ,phospho và lưu huỳnh tối ưu cần bổ sung cho quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men Rhodotorula