3.3.1.1. Bảo quản, vận chuyển phôi cá tra
Trứng cá tra sau khi thụ tinh ựược vận chuyển tới phòng thắ nghiệm trong vòng 6h. Trứng cá tra ựược bảo quản trong túi nylon có bơm khắ oxy ở nhiệt ựộ 27 Ờ 29oC.
3.3.1.2. Chuẩn bị môi trường khử nước, bảo quản lạnh
Chuẩn bị môi trường khử nước: pha ựường sucrose (Sigma-Aldrich, USA) trong nước miliQ (Viện Công nghệ sinh học) với các nồng ựộ là 0,5; 1; 2M.
Chuẩn bị môi trường chất bảo quản lạnh: Pha từng chất bảo quản lạnh riêng (glycerol, propanediol 1,2, ethylene glycol và methanol (Sigma-Aldrich, USA)) trong nước miliQ (Viện Công nghệ sinh học) với nồng ựộ 1M.
Chuẩn bị môi trường khử nước kết hợp chất bảo quản lạnh: Pha trong nước miliQ (Viện Công nghệ sinh học) các môi trường Glycerol 1M Ờ sucrose 0,5M, Glycerol 1M Ờ sucrose 1M, Proh 1M Ờ sucrose 0,5M, Proh 1M Ờ sucrose 1M, EG 1M Ờ sucrose 0,5M, EG 1M Ờ sucrose 1M, MET 1M Ờ sucrose 0,5M, MET 1M Ờ sucrose 1M.
3.3.1.3. Phương pháp thu phôi cá tra
Chuyển phôi cá tra từ bể nuôi ựưa vào ựĩa petri to (petri dish, 60x15mm, Sigma, USA) chứa nước lọc. Chọn lọc những phôi cá tra ở giai ựoạn somite stage (ựã phân ựốt), phôi sáng, nguyên vẹn dưới kắnh hiển vi soi nổi với ựộ phóng ựại 10.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
Thắ nghiệm 1: Khử nước phôi cá tra ở nhiệt ựộ phòng (27 Ờ 30oC)
Lô thắ nghiệm: Khử nước phôi cá tra ở nhiệt ựộ phòng với các nồng ựộ sucrose 0,5; 1; 2M trong thời gian 15Ỗ và 2h sau ựó tiến hành nuôi phôi
Lô ựối chứng: Phôi cá tra ựược nuôi trong nước cất ở nhiệt ựộ phòng Chuyển phôi cá tra ựã ựược chọn lọc cho vào ựĩa 4 lỗ (4-well dish, Sigma, USA), hút nước ra, cho vào mỗi lỗ 0,2 ml môi trường sucrose (0,5; 1; 2M Ờ lô thắ nghiệm) và cho vào 0,2 ml nước cất ở lô ựối chứng. để ựĩa ở nhiệt ựộ phòng trong thời gian 15Ỗ, 2h sau ựó tiến hành rửa môi trường khử nước 3 Ờ 4 lần bằng nước cất sau ựó tiến hành nuôi phôi ựánh giá sự sống, phát triển.
Nhiệt ựộ phòng ựược khống chế ở 27 Ờ 30oC sử dụng ựiều hòa 2 chiều. Mỗi lô thắ nghiệm sử dụng từ 20 - 50 phôi cá tra. Thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần.
3.3.1.5. Phương pháp xử lý phôi cá tra ở nhiệt ựộ thấp Thắ nghiệm 2: Xử lý phôi cá tra ở nhiệt ựộ thấp
Chuyển phôi cá tra ựã ựược chọn lọc cho vào trong 0,2 ml nước cất trong ựĩa 4 lỗ, rồi ựưa các ựĩa này vào tủ lạnh có các mức nhiệt ựộ là 4, 0, -20, và -50oC trong thời gian 15, 60 và 120 phút. Sau ựó giải ựông ở nhiệt ựộ phòng, cho thêm 0,4 ml nước cất vào mỗi lỗ rồi nuôi ở nhiệt ựộ phòng ựể ựánh giá tỷ lệ sống và tỷ lệ nở của phôi cá tra.
Thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần. Mỗi lô thắ nghiệm sử dụng 20 Ờ 40 phôi cá tra.
3.3.1.6. Phương pháp khử nước phôi cá tra ở nhiệt ựộ thấp Thắ nghiệm 3: Khử nước ở nhiệt ựộ thấp
Các lô thắ nghiệm và ựối chứng tương tự giống thắ nghiệm 1.
Tiến hành thắ nghiệm tương tự như thắ nghiệm 1, sau khi cho môi trường sucrose (lô thắ nghiệm) hoặc nước (lô ựối chứng) thì ựể ựĩa trong tủ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
lạnh có nhiệt ựộ 4, 0 và Ờ 20oC. Sau thời gian 15Ỗ, 2h ựưa ựĩa ra giải ựông ở nhiệt ựộ phòng, sau ựó tiến hành rửa 3 Ờ 4 lần bằng nước cất rồi nuôi phôi ựánh giá ựộ nguyên vẹn, sự sống, sự phát triển.
Mỗi lô thắ nghiệm sử dụng từ 20 - 40 phôi cá tra. Thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần.
3.3.1.7. Phương pháp xử lý với chất bảo quản lạnh
Thắ nghiệm 4: Ảnh hưởng của các chất bảo quản lạnh riêng lẻ ở nhiệt ựộ phòng và nhiệt ựộ thấp
Lô thắ nghiệm: xử lý với từng chất bảo quản lạnh riêng lẻ (Glycerol, Proh, EG, MET) nồng ựộ 1M trong 1h và 3M trong thời gian 15Ỗ ở nhiệt ựộ phòng và nhiệt ựộ thấp (0, -20oC)
Lô ựối chứng: chất bảo quản lạnh ựược thay bằng nước cất.
Cho phôi cá tra ựã chọn lọc vào ựĩa 4 lỗ, hút nước ra, cho 0,2 ml môi trường chất bảo quản lạnh (lô thắ nghiệm) hoặc 0,2 ml nước cất (lô ựối chứng) vào 1 lỗ ựể ở nhiệt ựộ phòng hoặc nhiệt ựộ thấp trong thời gian tương ứng với nồng ựộ chất bảo quản lạnh, sau ựó tiến hành rửa môi trường chất bảo quản lạnh 3 Ờ 4 lần bằng nước cất. Tiến hành nuôi phôi ựánh giá tỷ lệ nở của phôi cá tra.
Mỗi lô thắ nghiệm nồng ựộ chất bảo quản 1M sử dụng 30 phôi cá tra, còn lô thắ nghiệm với chất bảo quản nồng ựộ 3M sử dụng 20 Ờ 50 phôi. Thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần.
3.3.1.8. Phương pháp xử lý khử nước kết hợp xử lý chất bảo quản lạnh
Thắ nghiệm 5: Ảnh hưởng của khử nước kết hợp chất bảo quản lạnh ở nhiệt ựộ phòng và nhiệt ựộ thấp (0, - 20oC)
Cho phôi ựã chọn lọc vào ựĩa 4 lỗ, hút nước ra, sau ựó cho 0,2 ml môi trường khử nước kết hợp chất bảo quản lạnh (Glycerol 1M Ờ sucrose
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
0,5M, Glycerol 1M Ờ sucrose 1M, Proh 1M Ờ sucrose 0,5M, Proh 1M Ờ sucrose 1M, EG 1M Ờ sucrose 0,5M, EG 1M Ờ sucrose 1M, MET 1M Ờ sucrose 0,5M, MET 1M Ờ sucrose 1M ) vào ựể ở nhiệt ựộ phòng hoặc nhiệt ựộ thấp trong 1h, rồi rửa môi trường bằng nước cất, tiến hành nuôi phôi, ựánh giá sự sống, phát triển.
Mỗi lô thắ nghiệm sử dụng 30 phôi cá tra. Thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần.
3.3.1.9. Phương pháp nuôi phôi và ựánh giá sự sống, phát triển của phôi
Sau khi xử lý khử nước hoặc xử lý chất bảo quản lạnh, cho vào mỗi lỗ khoảng 0,4 Ờ 0,6 ml nước cất, ựể ựĩa ở nhiệt ựộ phòng.
Sự sống của phôi ựược ựánh giá bằng hiện tượng tim ựập và sự chuyển ựộng ựuôi cá bên trong phôi sau khi xử lý khoảng 30Ỗ Ờ 1h.
Sự phát triển của phôi ựược ựánh giá bằng sự nở của phôi cá tra sau mỗi thắ nghiệm bao gồm cá nở sống (cá di chuyển và hình dạng bình thường) hoặc cá nở chết (cá nở chết, không vận ựộng, tim không ựập hoặc cá nở dị tật, ựuôi ngắn, cong, khó di chuyển).
3.3.1.10. Các chỉ tiêu theo dõi, ựánh giá
Tỷ lệ phôi sống (%) = tổng số phôi sống/ tổng số phôi thắ nghiệm x 100, Tỷ lệ cá nở sống = tổng số cá nở sống/ tổng số phôi thắ nghiệm x 100, Tỷ lệ cá nở chết = tổng số cá nở chết/ tổng số phôi thắ nghiệm x 100.