Lahnsteiner F (2008) [28] ựã nghiên cứu ảnh hưởng của những chất bảo quản lạnh nội bào (DMSO, 1,2-propanediol, glycerol, ethylene glycol, methanol, N,N-dimethylacetamide) và ngoại bào (glucose và sucrose) lên sự sống và chỉ số hình thái phôi cá ngựa vằn (Danio rerio). Kết quả chỉ ra những chất bảo quản lạnh ngoại bào kém ựộc hơn các chất bảo quản lạnh nội bào. Giai ựoạn phát triển sớm thì nhạy cảm với chất bảo quản lạnh hơn là giai ựoạn muộn. Tất cả dung dịch ựông lạnh nhanh ựược kiểm tra cho kết quả vượt quá sức chống chịu của phôi. Sức chống chịu của phôi cá ngựa vằn với chất bảo quản lạnh có thể thay ựổi cao, trong một sự thay ựổi nồng ựộ có thể gây chết 50% phôi. Noãn hoàng không có sự thay ựổi các chỉ số hình thái rõ rệt. Nghiên cứu chỉ ra khử nước noãn hoàng là không thể và những dung dịch ựông lạnh nhanh vượt trên giới hạn chống chịu của phôi dường như không chắc chắn rằng sự thành công của ựông lạnh nhanh phôi cá ngựa vằn có thể xảy ra. Dưới những cân nhắc ựó thì ựông lạnh chậm có thể là ý tưởng tốt hơn khi những nồng ựộ thấp hơn của chất bảo quản lạnh ựược sử dụng và phôi có thể khử nước trong suốt quá trình ựông lạnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 27
Rahman SM và cs (2011) [49] ựã ựánh giá ảnh hưởng của xử lý biến ựổi áp lực và hóa học ựể cải thiện tắnh thấm của chất bảo quản lạnh DMSO tới phôi cá Japanese whiting. Tắnh thấm chất bảo quản lạnh thấp là một trong những yếu tố chắnh cản trở bảo quản lạnh thành công phôi cá. Phôi cá giai ựoạn phân ựốt và kéo dài ựuôi ựược xử lý với dung dịch ựường ưu trương (1M trehalose và sucrose) khoảng 2 Ờ 6Ỗ hoặc 1 chất thấm (2 Ờ 6 mg/ml pronase) khoảng 30 Ờ 120Ỗ và sau ựó pha với 10 Ờ 15% DMSO trong nước biển nhân tạo hoặc dung dịch nước chứa muối vô cơ (0,125 Ờ 0,5M MgCl2 và CaCl2). Khả năng sống của phôi sau xử lý ựược ựánh giá từ tỷ lệ nở và nồng ựộ DMSO nội bào ựược ựo bởi HPLC. Xử lý với trehalose khoảng 3Ỗ trước khi cho vào DMSO tăng tắnh thấm của chất bảo quản lạnh lên 45% mà không ảnh hưởng tới sức sống của phôi, trong khi ựó pronase không có ảnh hưởng ựáng kể lên tắnh thấm của chất bảo quản lạnh. Sự xâm nhập của DMSO vào phôi ựược tăng lên 143 Ờ 170% trong sự có mặt của muối hữu cơ so với nước biển. Sự kết hợp xử lý với trehalose và MgCl2 hiệu quả hơn trong ựiều khiển tắnh thấm của DMSO (191% so với phôi không xử lý). Phôi giai ựoạn kéo dài ựuôi chống chịu kém với những xử lý ựó nhưng có tắnh thấm DMSO cao hơn. Tóm lại, sử dụng trehalose (như một chất khử nước) và MgCl2/CaCl2 (như phương tiện trong quá trình thấm) ựẩy mạnh chất bảo quản thấm qua và có thể hứa hẹn cho bảo quản lạnh thành công phôi cá.
Tiantian Zhang và David M. Rawson (1995) [66] ựã nghiên cứu tắnh nhạy cảm lạnh của phôi cá ngựa vằn (Brachydanio rerio) ở 10 giai ựoạn phát triển. Ảnh hưởng của chất bảo quản lạnh tới tắnh nhạy cảm lạnh cũng ựược nghiên cứu. Sự có mặt của sucrose hoặc trehalose làm tăng rõ rệt tắnh chống chịu của phôi với làm lạnh. Methanol là chất bảo quản lạnh tối ưu cho bảo quản lạnh không ựông lạnh của phôi ở nhiệt ựộ 0oC và nhiệt ựộ âm. Nồng ựộ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
tối ưu của methanol khi bổ sung với sucrose 0,1M phụ thuộc vào từng mức nhiệt ựộ: 1M ở 0oC, 2M ở -5oC, 3M ở -10 oC, và 5M ở -15 oC, với tỷ lệ sống của phôi tương ứng là 30,2 ổ 3,5; 28,6 ổ 5,8; 27,3 ổ 12,1 và 14,3 ổ 4,2% sau khi bảo quản 48, 24, 6 và 1h. Sự giảm khả năng sống của phôi có thể liên quan tới tổn thương lạnh, tắnh ựộc của chất bảo quản, stress áp lực thẩm thấu, hoặc tác nhân khác.
Bảo quản lạnh phôi cá vẫn là một vấn ựề chưa ựược giải quyết. đông lạnh chậm phôi cá ựường như là không thể do nhiệt ựộ hình thành tinh thể ựá trong cấu tạo nhân cao. Vì thế, hầu hết các nghiên cứu tập trung vào các thắ nghiệm ựông lạnh nhanh sử dụng các loài cá nước ngọt và nước mặn và các chế ựộ ựông lạnh nhanh khác nhau (Robles và cs, 2003a [55]; Cabrita và cs, 2006 [6]; Chen và Tian, 2005 [8]). Tất cả các protocol ựều thất bại, phôi ựông lạnh Ờ giải ựông không thể tiếp tục phát triển thành ấu trùng. Do ựó, những kỹ thuật ựặc biệt như ựưa vào trong phôi những protein chống ựông (Robles và cs, 2003b [56]; Robles và cs, 2007 [57]), tiêm chất bảo quản lạnh vào noãn hoàng (Janik và cs, 2000 [19]), ựông lạnh những phôi có sức ựề kháng lạnh cao (những loài thắch nghi lạnh) (Robles và cs, 2003b [56]; Hagedorn và cs, 1997 [22]) và ựưa aquaporin-3 vào trong màng tế bào (Hagedorn và cs, 2002 [23]) ựã ựược kiểm tra. Tuy nhiên, những kỹ thuật này cũng không thành công trong sản xuất phôi sống sau ựông lạnh Ờ giải ựông. Tắnh thấm màng thấp của noãn hoàng và sự hình thành tinh thể ựá trong suốt giải ựông ựược cho là những bước mấu chốt trong bảo quản lạnh (Hagedorn và cs, 1998 [25]). Nhiều nghiên cứu ựã sử dụng thời gian cân bằng rất ngắn trong dung dịch chất bảo quản lạnh. Tuy nhiên, do tắnh thấm màng thấp nên phôi cá cần ựược nhúng trong dung dịch chất bảo quản lạnh ở nồng ựộ và thời gian cao nhất có thể chống chịu. Phôi cá có thành phần nước cao. để giảm sự hình thành tinh thể ựá thì khử
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29
nước hóa học với những chất bảo quản lạnh ngoại bào là cần thiết trước khi ựông lạnh. Mặc dù một vài phương pháp ựã thêm chất bảo quản lạnh ngoại bào vào dung dịch ựông lạnh nhanh (Robles và cs, 2003a [55]; Cabrita và cs, 2006 [6], Robles và cs, 2003b [56]) nhưng tắnh ựộc và hiệu quả của chất bảo quản lạnh ngoại bào vẫn chưa ựược nghiên cứu chi tiết.
Tuy ựã có những nghiên cứu liên quan tới ảnh hưởng của chất bảo quản lạnh nội bào và ngoại bào lên sự sống của trứng, phôi cá nhưng hầu hết ựều tập trung trên mô hình trứng, phôi cá ngựa (Lahnsteiner F, 2008 [28]; Seki S và cs, 2011 [63]). Mặc dù phôi cá ngựa ựược cho là mô hình quan trọng ựể nghiên cứu bảo quản lạnh phôi nhưng phôi của mỗi loài cá lại có những ựặc ựiểm riêng. Tuy nhiên, việc nghiên cứu ảnh hưởng của chất bảo quản lạnh ngoại bào (sucrose) riêng lẻ và khi kết hợp với một số chất bảo quản lạnh nội bào khác (glycerol, methanol,..) lên sự sống và phát triển của phôi cá tra
Pangasianodon hypophthalmus vẫn chưa ựược nghiên cứu.