vú, lợn
P. Barfield và cs (2009) [4] ựã nghiên cứu ảnh hưởng của khử nước trước khi bảo quản lạnh phôi mèo lớn. Một thắ nghiệm với hợp tử chuột chỉ ra rằng sức chống chịu của phôi với các nồng ựộ ựường ựơn và ựường ựôi lên tới 1,5M trong 10Ỗ làm giảm 85% nước tế bào, 75% phôi vẫn có khả năng phát triển tới blastocyst thoát màng sau khi hồi phục áp lực thẩm thấu. Phôi mèo cũng có thể ựược lợi từ sử dụng ựường ựể tăng khử nước trước ựông lạnh hoặc ựể ngăn cản sự phình ra quá ức trong quá trình giải ựông, cả hai ựiều này ựều ựặc biệt quan trọng cho phôi lớn.
Nghiên cứu của J.-P. Renard và cs (1984) [53] chỉ ra rằng sự kết hợp của khử nước một phần phôi thỏ ở nhiệt ựộ phòng với một chất bảo quản lạnh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30
thấm ựưa ra một phương pháp ựơn giản cho sự ựông lạnh và giải ựông nhanh của phôi thỏ. Phôi 2 tế bào trong dung dịch 2,2M propanediol ựược nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng, chỉ một vài trong số chúng sống sau giải ựông (8%), trong khi ựó phôi ựược xử lý trước với sucrose, giữ ở - 30oC trong 30 Ờ 240Ỗ trước khi nhúng vào nitơ lỏng, tỷ lệ sống rất cao 77 Ờ 88%.
Nguyen và cs (2000) [44] ựã nghiên cứu ựông lạnh phôi bò blastocyst (ngày 7 Ờ 8) thu từ cấy chuyển nhân tế bào sinh dưỡng sử dụng khử nước một phần và ựông lạnh nhanh. Thắ nghiệm 1, phôi bò ựược ựông lạnh bằng dung dịch PBS chứa 60% ethylene glycol, tỷ lệ sống và thoát màng là 44 và 95% với phôi cấy chuyển nhân và 78 và 55% với phôi thụ tinh ống nghiệm. Thắ nghiệm 2, phôi ựược ựông lạnh kết hợp khử nước một phần sử dụng dung dịch chứa 39% ethylene glycol + 0,7M sucrose và 8,6% Ficoll, tỷ lệ sống và thoát màng là 93 và 95% với phôi cấy chuyển nhân và 77 và 85% với phôi thụ tinh ống nghiệm. Kết quả cho thấy phôi bò blastocyst ngày 7 Ờ 8 có thể ựược bảo quản lạnh mà không mất khả năng sống với một phương pháp ựơn giản và hiệu quả sử dụng kết hợp khử nước một phần và ựông lạnh nhanh.
Ảnh hưởng của khử nước một phần lên khả năng sống của phôi chuột blastocyst bảo quản ở nhiệt ựộ âm mà không ựông lạnh ựã ựược P.S. Fiser và cs (1992) [16] nghiên cứu. Phôi ựược cân bằng với 3% môi trường A hoặc 6 % môi trường B chứa 0 Ờ 0,5M sucrose. Phôi ựược ựặt trong cọng rạ 0,25ml, làm lạnh tới Ờ 5 hoặc Ờ 10oC và bảo quản trong 3 ngày. Sau ựó, phôi ựược nuôi 48h trong môi trường M16 và khả năng phát triển thành blastocyst lớn hơn ựược sử dụng ựể ựánh giá sự sống của phôi sau bảo quản lạnh. Hiệu quả tốt nhất của khử nước riêng phần xuất hiện trong môi trường bổ sung 0,3 Ờ 0,5 M sucrose: tỷ lệ phôi ựã khử nước sống sau 24h bảo quản ở - 5ồC và - 10ồC là 84 Ờ 85% và 91 Ờ 100% so với chỉ 58 và 52% của phôi bảo quản lạnh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
không khử nước. Tỷ lệ phôi khử nước sống sau 48h và 72h bảo quản ở - 5oC là 86 Ờ 92% và 38 Ờ 58% so với 13% và 4% của phôi không khử nước. Tương tự, tỷ lệ phôi khử nước sống sau 48 và 72h ở - 10oC là 75 Ờ 85% và 47 Ờ 55% so với chỉ 5% và 0% của phôi không khử nước. Kết quả cho thấy giảm thành phần nước của phôi chuột blastocyst cải thiện khả năng chống chịu khi bảo quản ở nhiệt ựộ âm.
Edgar DH và cs (2009) [10] nghiên cứu ảnh hưởng của tăng khử nước phôi người giai ựoạn phôi chia trước khi làm lạnh chậm lên sự sống sau ựông lạnh. Kết quả cho thấy khử nước với sự có mặt của 0,2M sucrose tăng rõ rệt tỷ lệ phôi sống, tỷ lệ phôi bào sống và phôi nguyên vẹn (92,6%; 91,1% và 80,4%) so với khử nước trong 0,1M sucrose tỷ lệ này tương ứng (78,5%; 74,1% và 54,6%).
Trong thắ nghiệm của Lin L và cs (2009a) [30], trứng lợn ựược xử lý với những nồng ựộ gây chết của NaCl (593 và 1306 mOsm). Sau một chu kì hồi phục kế tiếp ựông lạnh nhanh và và hoạt hóa sinh sản ựơn tắnh hay cấy chuyển nhân tế bào sinh dưỡng, tỷ lệ blastocyst tăng rõ rệt trong nhóm xử lý với dung dịch NaCl ưu trương so với ựối chứng. Trong nghiên cứu tiếp sau, Lin L và cs (2009b [31]), ảnh hưởng của các chất osmotic ựược so sánh. Trứng ựược nhúng vào 588 mOsm NaCl, sucrose, trehalose khoảng 1h, sau ựó ựông lạnh nhanh và hoạt hóa sinh sản ựơn tắnh. Ở cả 3 thắ nghiệm ựều ựánh giá tỷ lệ blastocyst so với ựối chứng. Khi hoạt hóa sinh sản ựơn tắnh ựược thay thế với cấy chuyển nhân tế bào sinh dưỡng, tất cả các xử lý với dung dịch ưu trương ựều tăng tỷ lệ blastocyst, nhưng xử lý với trehalose và sucrose làm giảm ựáng kể số lượng tế bào trong blastocyst.
Bảo quản lạnh trứng và phôi nhiều loài ựộng vật có vú (bò, chuộtẦ) ựã thành công. Tuy nhiên, bảo quản lạnh thành công trứng và phôi lợn ựã và
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
ựang gặp thách thức, vẫn chưa có lợn con ựược sinh ra từ trứng lợn ựông lạnh, do tắnh nhạy cảm của chúng với các tổn thương lạnh. Trứng lợn rất nhạy cảm với làm lạnh dưới nhiệt ựộ dưới nhiệt ựộ sinh lý (Fahy và cs, 1984 [12]). Bởi vì tắnh nhạy cảm lạnh, phương pháp làm lạnh nhanh ựã ựược tập trung ựể cố gắng bảo quản trứng lợn (Fujihira và cs, 2005 [17]; Nagashima và cs, 1999 [41]); tuy nhiên, tổn thương tới thoi vô sắc và khả năng phát triển vẫn là một vấn ựề (Shi và cs, 2006 [62]; Wu và cs, 2006 [76]). để ngăn cản sự hình thành tinh thể ựá khi làm lạnh với tốc ựộ cao, nồng ựộ cao của những dung dịch thấm và không thấm qua màng cần ựược sử dụng như là chất bảo quản lạnh (Fahy và cs, 1984 [12]). Nhưng nhúng tế bào vào dung dịch có nồng ựộ cao có thể gây tổn thương do ựộc tắnh hóa học trực tiếp của những thành phần ựó và cũng do tác ựộng của áp lực thẩm thấu.
Mặc dù ựã có những nghiên cứu liên quan tới khử nước hay biến ựổi áp lực thẩm thấu lên sự phát triển của trứng lợn (Mullen SF và cs, 2007 [40]; Lin L và cs 2009a [30], b [31]) nhưng những nghiên cứu ựó chỉ tiến hành ở nhiệt ựộ sinh lý của trứng lợn chứ chưa ựược nghiên cứu ở nhiệt ựộ thấp.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
PHẦN III. đỐI TƯỢNG - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU