Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 23
Nguyên lý của bảo quản lạnh trứng, phôi ựộng vật: 1) khống chế trạng thái nước, 2) giảm tác ựộng của nhiệt ựộ thấp, shock nhiệt và 3) sử dụng hiệu quả tổ hợp các chất chống ựông, khử nước và nhiệt ựộ thấp.
1) Khống chế trạng thái nước:
Nước là yếu tố quan trọng quyết ựịnh kết quả của bảo quản lạnh. để ngăn cản sự hình thành tinh thể ựá trong quá trình làm lạnh và làm ấm, nước phải ựược loại khỏi tế bào ở mức tối ựa có thể.
Tinh thể ựá ựược hình thành trong suốt quá trình làm lạnh nhanh khi không ựủ thời gian ựể nước thoát ra khỏi tế bào. Do ựó, những tinh thể ựá lớn hình thành trong các thành phần nội bào. Những tinh thể này sẽ phá vỡ màng tế bào và gây tổn thương nội bào. Nếu trứng ựược khử nước trước khi những tinh thể ựá lớn hình thành trong nhân và tế bào chất thay vào ựó là nhiều tinh thể nhỏ hơn, tinh thể ựá hình thành bên ngoài tế bào thì sẽ không gây tổn thương nhiều cho tế bào. Vì vậy, khử nước của trứng xuất hiện trong quá trình bảo quản lạnh là cần thiết cho sự sống của trứng.
Khử nước trước làm lạnh ựã ựược chỉ ra là có tương hợp với sự sống của một vài loại tế bào ựông lạnh Ờ giải ựông, chẳng hạn tế bào da, tế bào bị khô một phần trong không khắ trước khi ựông lạnh (Taylor và Gerstner, 1954 [65]) hoặc tế bào máu co lại sau khi nhúng vào dung dịch ưu trương chứa sucrose - dung dịch không thấm - ở nhiệt ựộ phòng (Mazur và cs, 1974 [36]).
2) Giảm tác ựộng của nhiệt ựộ thấp, shock nhiệt:
Sucrose ựược biết là một chất không thấm qua màng, có thể sử dụng ựể tiến hành khử nước phôi và tế bào. Ngoài ra, sucrose cũng có tác ựộng bảo vệ màng khỏi ảnh hưởng của shock nhiệt. Thắ nghiệm của Nguyen (1989) [80], Gerard và cs ( 1991) [18] cho thấy cấu trúc xương và màng phôi có thể bị phá vỡ hoàn toàn khi nhiệt ựộ môi trường chứa phôi hạ ựến -20oC, nhưng có thể
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 24
ựược bảo tồn nguyên vẹn và phục hồi hoạt ựộng bình thường nếu phôi ựược xử lý khử nước và bảo vệ màng bằng dung dịch sucrose .
3) Sử dụng hiệu quả tổ hợp các chất chống ựông, khử nước và nhiệt ựộ thấp: Khi kết hợp với những tác ựộng bảo vệ cung cấp bởi một hợp chất thấm như glycerol hay dimethylsulphoxide (DMSO), khử nước trước ựông lạnh cũng có thể tăng sự sống của nguyên bào sợi hoặc phôi chuột (Smorag và cs,1981 [65]; Massip và Van der Zwalmen, 1982 [70]).
Các phương pháp bảo quản lạnh trứng, phôi ựộng vật gồm có:
1/ Phương pháp ựông lạnh chậm: Năm 1971, Whitingham và cs [73] công bố kết quả nghiên cứu ựông lạnh phôi chuột trên cơ sở kết hợp các chất chống ựông và khử nước với thiết bị hạ nhiệt tự ựộng (Hình 2.1)
Hình 2.1: Biến ựổi nhiệt ựộ theo quy trình ựông lạnh chậm và giải ựông chậm của Whitingham và cs (Nguyen và cs, 1984 [42])
2/ Phương pháp ựông lạnh nhanh: Mười năm sau thắ nghiệm của Whitingham, Nguyen và Renard ựã ựề xuất và thực nghiệm thành công nguyên lý ựông lạnh nhanh trên mô hình phôi thỏ và phôi bò (Nguyen và cs, 1983 [43], 1984 [42]; Renard và cs, 1984 [53]).
Nhiệt ựộ (oC)
0 - 3Ỗ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 25
3/ Phương pháp ựông lạnh cực nhanh (vitrification): Nguyên lý khử nước bộ phận ựã ựược Rall và Fahy (1985) [51] sử dụng ựể phát triển phương pháp ựông lạnh cực nhanh. RT -196oC -30oC Clacsic slow programable freezing 5Ỗ 30 Ỗ 300-500Ỗ Rabbit, cattle Survival in vitro: 60-88% In vivo: 33-81% Sucrose-PROH, 2 min, Room temperature Rapid freezing (Nguyen, Renard,1983, 1984)
Hình 2.2: Sơ ựồ khử nước, thời gian và biến ựổi nhiệt ựộ trong các kiểu ựông lạnh chậm, ựông lạnh nhanh và ựông lạnh cực nhanh (Nguyen và cs, 1984 [42])
Hình 2.3: Nguyên tắc ựông lạnh cực nhanh
đông lạnh nhanh phôi ựộng vật gồm có sự giảm những dung dịch chất bảo quản lạnh thấm nồng ựộ cao. Những chất bảo quản lạnh ựó ựược biết là
đông lạnh nhanh Nguyen và Renard 1983, 1984 Chương trình ựông lanh chậm Thỏ, bò TL sống in vitro: 60-88% TL sống in vivo: 33-81% Sucrose-Proh, 2Ỗ Nhiệt ựộ phòng (RT) 5Ỗ 30Ỗ 300-500Ỗ
Tế bào trong dung
dịch ở 37oC
đông lạnh đông lạnh cực nhanh
Làm lạnh rất chậm Làm lạnh trung bình Làm lạnh nhanh Dưới (D). Sống (C). Chết (A). Sống? (B).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 26
có tắnh ựộc với tế bào ở trạng thái không ựông lạnh. Trong thắ nghiệm của M. El-Gayar và cs (2011) [10], họ dự ựịnh giảm số lượng chất bảo quản lạnh thấm qua màng tế bào tới mức tối thiểu bởi khử nước một phần tối thiểu phôi bào trước khi nhúng vào dung dịch ựông lạnh nhanh. Sucrose ựược biết là một chất không thấm qua màng có tác dụng thấm lọc và do ựó phù hợp với mục ựắch của nghiên cứu này. Kết quả nghiên cứu chỉ ra nhúng vào sucrose trước khi ựông lạnh nhanh làm hại khả năng sống của phôi chuột hơn là bảo vệ chúng nhưng ngược lại thêm sucrose vào dung dịch ựông lạnh nhanh thì không làm hại khả năng sống của phôi chuột.