Nhân nhanh cụm chồi là giai đoạn kích thích sự phân hóa các chồi từ một hay vài chồi ban đầu. Đây là giai đoạn không thể thiếu với một quy trình sản xuất giống bằng phương pháp nhân giống in-vitro. Trong giai đoạn này sự sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng),
môi trường nuôi cấy (thành phần dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng và tỉ lệ giữa chúng). Tùy theo từng loài cây mà người ta có thể bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ và tỉ lệ khác nhau để thu được hệ số nhân chồi và chất lượng chồi cao nhất.
Sau khi các hạt lai F1 nảy mầm được khoảng 7-10 ngày và đạt chiều cao khoảng 4-5 cm thì tiến hành bước tạo cụm chồi trong 2 nghiệm thức NC1 và NC2. Trong mỗi nghiệm thức, mỗi tổ hợp lai cấy 10 chồi, phân bố trong 3 bình tam giác 250ml, lặp lại 3 lần. Quan sát quá trình tạo cụm chồi ở một số khía cạnh: tốc độ nhân chồi, sức sống của các chồi cũng như khả năng thích ứng với môi trường tạo cụm chồi.
Bảng 3.2. Kết quả nuôi cấy in-vitro tạo cụm chồi hạt lai F1
S T T TỔ HỢP LAI SỐ HẠT NẢY MẦM SỐ CHỒI (3 TUẦN) SỐ CHỒI (5 TUẦN) HỆ SỐ NHÂN CHỒI (SAU 5 TUẦN) NC1 NC2 NC1 NC2 NC1 NC2 NC1 NC2 1 HT2/NTD2 30 30 72 70 240 138 8,00 ± 0,65 4,60 ± 0,60 2 NTD2/HT2 26 26 99 35 437 69 16,81 ± 1,75 2,65 ± 0,51 3 HT1/TX1-2 27 30 65 64 112 141 4,15 ± 0,77 4,70 ± 0,81 4 TX1-2/TD 27 30 40 45 68 66 2,51 ± 0,53 2,20 ± 0,40 5 NHĐB-TX93/TD 25 30 33 39 166 66 6,64 ± 1,46 2,20 ± 0,49 6 NTD2/TD 30 30 96 66 135 102 4,50 ± 1,02 3,40 ± 0,97 7 JAS/TD 30 30 73 57 394 103 13,13 ± 2,25 3.43 ± 1,09 8 NT1/BT7 30 30 36 57 111 75 3,70 ± 0,88 2,50 ± 0,53 9 NT1/HT2 25 30 67 80 383 94 15,32 ± 3,34 3,13 ± 0,57
Quan sát sự tạo cụm chồi của các chồi ban đầu sau 3 tuần và 5 tuần trong môi trường tạo cụm chồi thu được kết quả như bảng 3.2.
So sánh khả năng tạo cụm chồi của các tổ hợp lai trong 2 nghiệm thức NC1 và NC2 sau 5 tuần nhân chồi đều thấy, ngoại trừ tổ hợp lai HT1/TX1-2, tất cả các tổ
hợp lai còn lại đều cho kết quả nhân chồi tốt hơn khi nuôi trong NC1 (môi trường có nồng độ BA cao hơn), đáng chú ý là các tổ hợp NTD2/HT2, JAS/TD, NT1/HT2 có hệ số nhân chồi ở NC1 gấp 4-8 lần NC2. Điều này hoàn toàn phù hợp với những nghiên cứu về tác động sinh lí của nhóm cytokinin trong nuôi cấy mô thực vật, đó là khả năng tăng cường quá trình phát sinh chồi phụ, đặc biệt là của BA [5].
Tổ hợp HT1/TX1-2 tạo cụm chồi tốt hơn ở NC2, tổ hợp TX1-2/TD tạo cụm chồi trong 2 nghiệm thức không chênh lệch quá lớn (2,51 chồi ở NC1 và 2,20 chồi ở NC2).
Hệ số nhân chồi của tổ hợp lai TX1-2/TD và NT1/BT7 tỏ ra hạn chế trong cả 2 nghiệm thức, có lẽ đây chưa phải là môi trường nhân chồi thuận lợi cho 2 đối tượng này.
Quan sát tốc độ nhân chồi của các hạt lai thuộc các tổ hợp lai khác nhau chúng tôi nhận thấy, mặc dù đã được cấy nảy mầm trên chính môi trường dùng để nhân chồi nhằm tạo sự thích ứng nhanh chóng cho các chồi, nhưng sự phát triển của cụm chồi trong giai đoạn 3 tuần đầu tiên vẫn tương đối chậm, trung bình 1 chồi ban đầu nhân được 1-3 chồi mới. Sau 3 tuần, một số cụm chồi bị đen ở gốc, một vài chồi bị khô do cạn kiệt chất dinh dưỡng. Sau khi cấy chuyền đổi môi trường thì tốc độ nhân chồi tăng lên rõ rệt do các chồi đã thích nghi hoàn toàn với môi trường nuôi cấy, đồng thời chất dinh dưỡng được cung cấp dồi dào hơn nên đã phát triển thuận lợi, đáng chú ý là các tổ hợp 2, 7, 9 có hệ số nhân chồi sau 5 tuần đạt trung bình từ 13,13 đến 16,81chồi.
Xét về sức sống của các chồi thì thấy: các chồi được cấy trên môi trường NC1 tỏ ra ưu thế hơn các chồi cấy trên NC2, cụm chồi phát triển tương đối đồng đều, chồi to khỏe, cứng cáp và xanh tốt hơn. Đây là một đặc điểm thuận lợi cho việc tách riêng từng chồi trong quá trình tạo rễ để hình thành cây in-vitro hoàn chỉnh ở giai đoạn sau, vì bản thân các chồi nếu có sức sống cao thì việc tạo rễ sẽ dễ dàng, cũng như khả năng thích ứng với môi trường tự nhiên sẽ tốt hơn.
Như vậy, khả năng nhân chồi của các tổ hợp lai phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy, bản thân đặc điểm vật liệu nuôi cấy và khả năng thích ứng với môi trường
của mẫu cấy. Trong giới hạn của nội dung thực nghiệm, khả năng tạo cụm chồi trong NC1 có hiệu quả hơn NC2. Các tổ hợp lai thích hợp nhất với môi trường nuôi cấy NC1 để tạo cụm chồi là HT2/NTD2, NTD2/HT2, JAS/TD, NT1/HT2.
HT2/NTD2 NTD2/HT2 HT1/TX1-2
TX1-2/TD NHĐB-TX93/TD NTD2/TD
JAS/TD NT1/BT7 NT1/HT2
HT2/NTD2 NTD2/HT2 HT1/TX1-2
TX1-2/TD NHĐB-TX93/TD NTD2/TD
JAS/TD NT1/BT7 NT1/HT2
HT2/NTD2 NTD2/HT2 HT1/TX1-2
TX1-2/TD NHĐB-TX93/TD NTD2/TD
JAS/TD NT1/BT7 NT1/HT2
HT2/NTD2 NTD2/HT2 HT1/TX1-2
TX1-2/TD NHĐB-TX93/TD NTD2/TD
JAS/TD NT1/BT7 NT1/HT2